تصوير القفيصات الفيروسية المعالجة حرارياً باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ

خذ الأنابيب التي تحتوي على القفيصات الفيروسية، وهي جسيمات شبيهة بالفيروسات تفتقر إلى المادة الوراثية.

سخن الأنابيب عند درجة حرارة ثابتة لمدد زمنية متفاوتة.

تؤدي فترة التسخين القصيرة إلى إجهاد طفيف لبروتينات القفيصة، بينما يؤدي التسخين المطول إلى تفكك القفيصة وتسبب التجمعات.

برد الأنابيب بسرعة لمنع حدوث المزيد من التغيرات الهيكلية.

انقل السائل إلى غشاء بارافين.

ضع شبكة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) فوق القطرة. تلتصق الكابسيدات بسطح الشبكة.

جفف الشبكة باستخدام ورقة ترشيح لإزالة السائل الزائد.

اغسل باستخدام محلول منظم لإزالة القفيصات المرتبطة بشكل ضعيف، ثم جفف الشبكة مرة أخرى بالترشيح.

اغمرها في أسيتات اليورانيل، وهي صبغة معدنية ثقيلة ترتبط بسطح القفيصة، مما يجعلها تظهر بلون داكن تحت المجهر الإلكتروني النافذ TEM.

جفف الشبكة بقطعة من ورق الترشيح وضعها على طبق. احفظ الطبق في مجفف لإزالة الرطوبة.

قم بتصوير الشبكة باستخدام TEM لتصور التلف الذي أصاب الكابسيد والناتج عن الحرارة.

قم بإجراء المعالجة الحرارية كما سبق، باستثناء استبدال 10 millimolar HEPES، pH 7.4 بمحلول PBS، وعدم تخفيف الكابسيدات بشكل إضافي بعد المعالجة. بعد ذلك، قم بنقل قطرة كاملة بحجم 15 microliter من محلول الكابسيد المعالج إلى فيلم البارافين باستخدام الماصة. أمسك حافة الشبكة بالملقط مع السماح له بالإغلاق على الحافة لتثبيت الشبكة، ثم ضع الشبكة بحيث يكون جانب الكربون لأسفل فوق قطرة المحلول المعالج.

اترك الشبكة لتتحضن لمدة 10 دقائق للسماح للقفيصة بالارتباط بالشبكة. وبناءً على نقاء تحضير القفيصة، أضف غسلات من محلول HEPES على شكل قطرات بحجم 10 إلى 15 µL توضع في خط مستقيم بعد قطرة القفيصة المعالجة. وبعد 10 دقائق، ارفع الشبكة مع القطرة.

ضع الشبكة بشكل عمودي تقريبًا على قطعة من ورق الترشيح لامتصاص القطرة. بعد ذلك، استخدم الشبكة لالتقاط قطرة من محلول HEPES المنظم بحجم 10 إلى 15 microliter وثبتها لمدة 30 ثانية. وبعد انتهاء وقت الغسل البالغ 30 ثانية، امتص السائل باستخدام قطعة أخرى من ورق الترشيح.

بعد ذلك، ضع قطرة بحجم 15 µL من محلول uranyl acetate بتركيز 2% على فيلم البارافين في منطقة فارغة. ارفع قطرة uranyl acetate باستخدام الشبكة وثبتها لمدة 45 s. ثم، قم بامتصاص uranyl acetate مع التأكد من إزالة معظم المحلول.

ضع الشبكة بحيث يكون جانب الكربون للأعلى على قطعة من ورق الترشيح، مع الحرص على ألا تلتصق الشبكة بالرطوبة الموجودة على الملاقط. بعد ذلك، ضع ورق الترشيح الذي يحمل الشبكة في طبق بيتري زجاجي مفتوح. وبعد تكرار هذه العملية لجميع المعاملات، ضع أنصاف أطباق بيتري التي تحتوي على الشبكات في مجفف طوال الليل لتجف قبل فحصها باستخدام TEM.