نقل الجينات بوساطة العاثيات في البكتيريا الحلزونية

خذ مزرعة من بكتيريا السبيروكيت المعدلة وراثياً. تحمل هذه البكتيريا جين المقاومة للـ gentamicin.

أضف معلق البكتيريوفاج إلى المزرعة البكتيرية.

تحمل العاثيات حمض DNA بلازميدي يشفر جيناً لمقاومة الكاناميسين.

قم بحضن الخليط.

يلتصق العاثية (البكتيريوفاج) بسطح البكتيريا ويحقن الحمض النووي DNA داخل الخلية.

يتضاعف البلازميد بشكل مستقل وينتقل عند انقسام البكتيريا.

امزج المزرعة المحضنة مع وسط آغاروز منصهر مدعم بالمضادين الحيويين جنتاميسين وكاناميسين.

صُب الخليط في طبق. اتركه حتى يتصلب ثم قم بتحضينه.

تحت تأثير الانتقاء باستخدام مضادين حيويين، تنمو فقط الخلايا التي تحمل كلا علامتي المقاومة وتُشكل مستعمرات، بينما تموت الخلايا المتبقية.

اختر مستعمرة واحدة وقم بتلقيحها في وسط يحتوي على كلا المضادين الحيويين.

يتم التحضين لتسهيل نمو البكتيريا التي تحمل البلازميد المنقول من أجل إجراء المزيد من التحليلات اللاحقة.

قم بسكب السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 14.5 milliliters من BSK طازج. أضف 500 microliters أو أقل من عينة الفاج المرسبة بـ PEG إلى مزرعة السلالة المستقبِلة.

بعد الخلط جيداً، يتم التحضين عند 33 درجة Celsius لمدة تتراوح من 72 إلى 96 ساعة. يتم إجراء اختيار الخلايا المحولة عن طريق الزرع على وسط صلب بعد الخلط مع العاثيات المُرسبة بـ PEG كما هو موضح في المخطوطة. وبناءً على الخلفية الوراثية للمستنبت المستقبل، يتم التحقق من ظهور المستعمرات داخل الأجاروز في أطباق الاختيار بعد 10 إلى 21 يوماً من التحضين.

اختر ما لا يقل عن 5 إلى 10 مستعمرات نمت على الطبق في وجود كلا المضادين الحيويين باستخدام ماصة بوروسيليكات مقاس 5.75 بوصة ذات سدادة قطنية معقمة، وقم بتلقيحها في 1.5 milliliters من وسط BSK مع المضاد الحيوي المناسب.