نقل الجينات إلى عضوانيات الأمعاء الفأرية باستخدام النواقل الفيروسية البطيئة

ابدأ باستخدام عضوانيات معوية من الفأر تم تفكيكها جزئياً لتسهيل عملية التنقل الفيروسي العدسي.

خذ النواقل الفيروسية lentiviral في وسط ترانسدكشن (transduction medium).

يحمل الفيروس اللينتي (lentivirus) جيناً مستهدفاً لضمان التكامل المستقر في جينوم المضيف.

أضف الفيروس lentivirus إلى البئر.

يتم تحضين الخليط للسماح بدخول الفيروس.

يتم نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي عكسياً إلى حمض نووي ريبي منقوص الأكسجين (DNA) ثم يندمج في جينوم المضيف.

أضف وسط استزراع العضيّات وانقل الخليط إلى أنبوب.

قم بالطرد المركزي لإزالة أي فيروسات غير مرتبطة.

امزج الراسب في مصفوفة الغشاء القاعدي.

ضع العضويات في بئر واتركها حتى تتصلب.

تُشكل المصفوفة شبكة تحبس العضوانيات وتوفر دعماً هيكلياً.

أضف وسط استزراع العضوانيات المدعم بمحفزات النمو لدعم تكاثر العضوانيات.

ينتج عن ذلك عضوانيات برعمية تحتوي على الجين المنقول، والتي يمكن استخدامها في المزيد من التحليلات الوظيفية.

انقل العضوانيات في هذه الكمية الصغيرة الأخيرة من الوسط إلى بئر في طبق يحتوي على 48 بئرًا.

أضف الفيروس اللينتي (lentivirus) عالي العيار الذي تم تحضيره مسبقاً في وسط نقل العدوى إلى العضوانيات ثم أعد تعليقها. قم بتحضين خليط العضوانيات والفيروس لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعية للسماح بنقل العدوى. بعد مرور ساعة واحدة، أضف 1 مل من وسط زراعة العضوانيات إلى خليط العضوانيات والفيروس، وأعد التعليق، ثم انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وقم بالطرد المركزي عند 850 x g لمدة خمس دقائق.

لترسيب العضوانيات، أزل الطافي وأعد تعليق الراسب في 20 µL من Matrigel المبردة. ضع القطرة في منتصف بئر في طبق يحتوي على 48 بئراً، واحضنها عند 37 °C لمدة 15 دقيقة حتى تتصلب القطرة. بعد مرور 15 دقيقة، أضف بحذر 250 µL من وسط استنبات العضوانيات المدعم بالنيكوتيناميد ومثبطات الكيناز.