JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدات • 2:40 د • August 31st, 2026
خذ مستنبتات من خلايا سرطان الثدي.
العدوى المشتركة بنوعين من الفيروسات الغدية. يحمل أحدهما جين البروتين الفلوري الأخضر أو GFP تحت مُحفز نشط بنيوياً.
ويحتوي الآخر على جين مراسل يشفر البروتين الفلوري الأحمر أو RFP، تحت محفز مستجيب لـ SMAD.
أضف عامل النمو التحويلي بيتا (TGF-beta) إلى المزرعة الاختبارية ثم قم بالتحضين.
ترتبط الفيروسات بالمستقبل للدخول إلى الخلية المضيفة، وتوصيل الجينات إلى النواة، وتمكين تعبير GFP.
في الخلايا المختبرة، يرتبط TGF-beta بمستقبلاته وينشط مسار SMAD عن طريق فسفرة بروتيني SMAD2 وSMAD3.
تُشكّل هذه البروتينات معقداً مع SMAD4.
يرتبط هذا المعقد بمحفز الجين المراسل، مما يسمح بالتعبير عن RFP بالإضافة إلى GFP.
في مجموعة الضبط، يظل مسار SMAD غير نشط، مما يسمح للخلايا بالتعبير عن GFP فقط.
التقط صورًا فلورية للخلايا الحية.
يؤكد وجود كلتا الإشارتين تنشيط مسار SMAD باستخدام ترنسدكشن مزدوج للفيروس الغدي.
في يوم الإصابة بالفيروس الغداني، قم بزراعة آبار طبق مكون من 12 بئراً بحوالي 1.25 × 10⁵ من خلايا MDA-MB-231 في 50 µL من الوسط الغذائي لتحقيق درجة تلاقي تبلغ 35%. قم بإصابة الخلايا في جميع الآبار بـ 75 µL من adenovirus-CMV-GFP و 7.5 µL من adenovirus CAGA12-Td-Tomato للحصول على تعددية إصابة (MOI) تبلغ 2,50، والتي يمكن أن تحقق إيجابية إصابة بنسبة 10%. ثم أضف TGF-beta إلى بئر المعالجة مباشرة بعد الإصابة بالفيروس الغداني.
يُحضن عند 37 درجة مئوية مع 10% ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. وفي اليوم التالي، يتم تصوير الخلايا الحية باستخدام مجهر فلوري بتباين طوري.