تنقية أجسام الإنتاسوم للفيروس الرغوي النموذجي بواسطة كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي

ابدأ بمعلق يحتوي على رواسب من الـ intasomes الخاصة بالفيروس الرغوي النموذجي (PFV)، والإنتغريزات أحادية القسيمة (monomeric integrases)، وقليلات السكر من الحمض النووي (DNA oligomers)، وتجمعات بروتينية.

إن الـ PFV intasomes هي رباعيات من إنزيمات التكامل الفيروسية المرتبطة بأوليغومرات اصطناعية تحاكي الحمض النووي الجينومي الفيروسي.

أضف محلول ملحي إلى المعلق واحضه على الثلج. حيث يقلل الملح من التفاعل الكهروسكوني بين الإنتاسومات، مما يسمح بإذابة الرواسب.

قم بالماصة بلطف على فترات زمنية منتظمة لتعزيز إذابة الـ intasome.

قم بإجراء عملية الطرد المركزي لترسيب ما تبقى من الراسب، واجمع السائل الطافي الذي يحتوي على الإنتاسومات الذائبة.

استخدم عمود كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي الذي تم موازنته مسبقاً والمعبأ بحبيبات الأغاروز المتشابكة، ثم قم بتحميل الطافي على العمود.

نظراً لحجمها الكبير، تتجاوز التجمعات البروتينية والإنتازومات مسام الخرزات وتخرج من العمود في وقت مبكر.

تدخل الإنتيجريزات أحادية القسيمة والأوليغومرات الأصغر حجماً في مسام الخرز وتخرج في وقت لاحق.

اجمع الكسور التي تخرج مبكرًا والتي تحتوي على الـ intasomes لإجراء المزيد من التحليلات اللاحقة.

قم بتجهيز طرفي ماصة ذات فتحة واسعة عن طريق إزالة من 2 إلى 4 ملم من نهاية طرف ماصة سعة 20 µL باستخدام شفرة حلاقة أو مشرط جديد على سطح نظيف. أخرج أنبوب الديلزة من محلول الديلزة المنظم. ولمنع تخفيف عينة الإنتاسوم بمحلول الديلزة الذي قد يتبقى في نهاية الأنبوب بالقرب من المشبك، استخدم ماصة دقيقة ذات طرف صغير لإزالة أي محلول ديلزة زائد.

قم بإزالة المشبك من هذه النهاية من أنبوب الدياليز. عند استعادة التجمع، من المهم جمع أكبر قدر ممكن من المحلول والراسب. استخدم طرف الماصة واسع الفتحة لنقل العينة، بما في ذلك الراسب، الموجودة داخل أنبوب الدياليز، إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter على الثلج.

سجّل الحجم الإجمالي للمادة المستعادة. عادةً ما يكون الحجم الإجمالي حوالي 140 µL. تكون العينة التي تحتوي على الراسب بتركيز 20 mM من كلوريد الصوديوم.

ارفع تركيز الملح إلى تركيز نهائي قدره 320 millimolar من كلوريد الصوديوم عن طريق إضافة الحجم المناسب من محلول مخزون بتركيز five molar من كلوريد الصوديوم. انقل وعاء الثلج الذي يحتوي على العينة إلى غرفة باردة درجة حرارتها four degree Celsius. استخدم طرف الماصة واسع الفتحة لإعادة تعليق الرواسب وإذابتها عن طريق السحب والضخ بالماصة.

كرر العملية كل 20 دقيقة لمدة ساعة واحدة على الأقل. يجب أن يذوب معظم الراسب في المحلول. ولتنقية الـ intasome، قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) من الأجاروز المترابط باستخدام محلول التشغيل الخاص بـ SEC بمعدل تدفق قدره 0.4 مللي لتر في الدقيقة.

قم بطرد عينة الـ intasome مركزياً في جهاز طرد مركزي صغير (microfuge) عند 14,0 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 ˚C لترسيب أي رواسب متبقية. بعد إزالة supernatant بعناية، قم بتحميله على حلقة حقن سعتها 200 µL. ثم ضع العينة في عمود SEC.

قم بعملية الشطف باستخدام 25 mL من منظم تشغيل SEC واجمع 95 جزءاً بحجم 270 µL لكل منها. لاحظ أن مخطط الكروماتوغرافيا SEC يظهر ثلاث قمم عند A280 وA260.