موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدة • 2:23 دقيقة • August 31st, 2026
ابدأ بمحلول قياسي من RNA فيروسي مُصنّع ومُخفف تسلسلياً في وسط الزرع.
تُستخدم هذه التخفيفات كمعايير مرجعية لتقدير كمية الـ RNA الفيروسي في العينات.
الآن، خذ الطافي الذي يحتوي على الفيروس من مستنبت الخلايا المصابة بالفيروس.
يحتوي وسط الزرع هذا على مثبط يرتبط بالإنزيمات المفككة للـ RNA ويمنع تحلل الـ RNA الفيروسي.
أضف محلول المعالجة الذي يحتوي على إنزيم proteinase K.
قم بطرد المحلول مركزياً لفترة وجيزة لضمان المزج المتجانس.
ضع لوحة PCR التي تحتوي على العينات في جهاز التدوير الحراري (thermocycler).
أولاً، يتم التحضين في درجة حرارة معتدلة لتنشيط proteinase K.
يقوم هذا الإنزيم بهضم البروتينات الفيروسية التي تغلف الجينوم، مما يؤدي إلى تحرير الـ RNA الفيروسي في المحلول.
بعد ذلك، يتم التحضين عند درجة حرارة أعلى لتعطيل الإنزيم ومسخ RNA.
أخيرًا، تُحفظ العينات المعالجة في ظروف تبريد حتى إجراء تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي.
أولاً، اخلط 199 µL من محلول المعالجة المنظم مع 1 µL من البروتيناز K الخالي من النوكلياز. وباستخدام وسط زراعة الخلايا، قم بتخفيف RNA الخاص بالمنطقة غير المترجمة 3' (3'UTR) لفيروس Dengue المُحضّر تخفيفاً تسلسلياً بنسبة 1:10 للحصول على معايير RNA بتركيزات تتراوح من 5,000,000 إلى 5,000 نسخة/µL عن طريق تكرار عملية السحب بالماصة والرج بجهاز الفورتكس. انقل 5 µL من السائل الطافي لزراعة الخلايا المصابة بفيروس Dengue ومعيار RNA الخاص بـ 3'UTR لفيروس Dengue إما إلى شرائط PCR ذات 8 أنابيب أو إلى آبار لوحة PCR ذات 96 بئراً.
أضف 5 μL من المحلول الذي يحتوي على منظم المعالجة وproteinase K. قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة بسرعة 200 ×g لمدة خمس ثوانٍ. قم بحضن العينات في جهاز الدورات الحرارية عند درجة حرارة 25 °C لمدة عشر دقائق، ثم عند درجة حرارة 75 °C لمدة خمس دقائق.