حصاد جزيئات فيروس التهاب الكبد E من خلايا سرطان الكبد البشرية

ابدأ بمزرعة من خلايا سرطان الكبد البشرية التي تم نقل RNA فيروس التهاب الكبد E (HEV) إليها لإنتاج الجسيمات الفيروسية.

تكتسب بعض فيروسات HEVs غشاءً إندوسومياً مشتقاً من المضيف وتخرج من الخلية، بينما تظل فيروسات أخرى داخل الخلية كفيروسات HEVs غير مغلفة.

لحصد فيروسات HEV خارج الخلوية، يتم جمع وترشيح المادة الطافية للمزرعة لإزالة الحطام الخلوي.

يُخزن في درجة حرارة منخفضة للغاية للحفاظ على القدرة الإعدائية.

لحصاد جزيئات HEVs داخل الخلايا، اغسل الخلايا بمحلول منظم.

أضف trypsin-EDTA لفصل الخلايا، ثم أضف وسطاً غذائياً لإيقاف النشاط الإنزيمي.

انقل المعلق إلى أنبوب وقم بإجراء عملية الطرد المركزي.

تخلص من الطافي الذي يحتوي على بقايا التريبسين. أعد تعليق الراسب وانقله إلى أنبوب.

جمّد الخلايا في النيتروجين السائل ثم قم بإذابتها على الثلج.

كرر دورات التجميد والإذابة لتحليل الخلايا، مما يؤدي إلى تحرير الفيروسات.

قم بإجراء الطرد المركزي، ثم اجمع الطافي الذي يحتوي على الفيروسات، وخزنه في درجة حرارة منخفضة للغاية.

في اليوم السادس، قم بترشيح السائل الطافي عبر غشاء بمسامية 0.45 micrometer لإزالة أي حطام خلوي، ثم خزن فيروس التهاب الكبد E المستخلص من المزرعة الخلوية والموجود خارج الخلايا عند درجة حرارة 4 degrees Celsius. ولحصد جزيئات فيروس التهاب الكبد E الموجودة داخل المزرعة الخلوية، اغسل الخلايا بمحلول PBS وقم بفصل الخلايا باستخدام 1.5 milliliters من trypsin-EDTA بتركيز 0.05% عند درجة حرارة 37 degrees Celsius. وعندما تنفصل الخلايا، أوقف التفاعل بإضافة 8.5 milliliters من وسط DMEM وانقل معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 50 milliliter لإجراء عملية الطرد المركزي.

أضف 1.6 milliliters من وسط DMEM الكامل لكل عملية تثقيب كهربائي في أنابيب تفاعل فردية سعة 2 milliliters، واستخدم 800 microliters من الوسط لإعادة تعليق الخلايا، وبذلك يتم نقل الخلايا إلى الأنابيب. قم بتجميد الخلايا في النيتروجين السائل، ثم أذب الخلايا على الثلج ثلاث مرات قبل إجراء طرد مركزي عالي السرعة للمحللات الناتجة لمدة 10 minutes عند 10,000 times g. بعد ذلك، انقل السوائل الطافية إلى أنابيب جديدة دون تعكير رواسب حطام الخلايا لتخزينها عند درجة حرارة minus 80 degrees Celsius.