تنقية الفيروس من السائل السلوي لبيوض الدجاج الملقحة

ابدأ بخزان يحتوي على السائل السلوي الذي تم جمعه من بيض الدجاج المصاب بالفيروس.

يحتوي هذا السائل على جسيمات فيروسية إلى جانب ملوثات مشتقة من المضيف.

مرر السائل عبر مرشح عمق لالتقاط الملوثات الكبيرة مع السماح للملوثات الأصغر والفيروسات بالمرور.

بعد ذلك، يتم تحميل السائل المُرشح في نظام ترشيح، حيث يتدفق بشكل مماسي عبر سطح غشاء.

تمر الملوثات الأصغر حجمًا عبر الغشاء، بينما يتم احتجاز الفيروس وتركيزه.

قم بتحميل الفيروس المركز على تدرج كثافة ثم قم بطرده مركزياً. يشكل الفيروس حزمة مميزة حيث تتطابق كثافته مع التدرج.

قم بجمع النطاق الغني بالفيروس في كاسيت دياليزة وضعه في محلول منظم. تنتشر مكونات التدرج إلى الخارج، بينما ينتشر الماء من المحلول المنظم إلى الداخل عبر الغشاء شبه المنفذ.

بعد ذلك، ضع الكاسيت في محلول عالي التوتر لسحب الماء وتركيز الفيروس المُنقى.

لتنقية فيروس مرض نيوكاسل أو NDV، قم أولاً بتجهيز النظام التجريبي الذي تم إعداده مسبقاً عن طريق تمرير 50 milliliters من PBS من خلاله.

أوقف المضخة عندما يتبقى حوالي 5 milliliters من PBS في الأنبوب. بعد ذلك، قم بتوصيل مرشح عميق (depth filter) بدرجة احتجاز تتراوح من 1 إلى 3 micromolar بالأنابيب. ولتفريغ المرشح من الهواء، قم بإزالة الغطاء الثاني من الجانب القمي لمرشح العمق، ثم ابدأ بتمرير 50 milliliters إضافية من PBS عبر النظام.

بمجرد أن يبدأ محلول PBS في التدفق عبر فتحة التهوية الموجودة في الجزء العلوي من المرشح، أغلق المنفذ واستمر في تدفق محلول PBS عبر الخطوط. بعد ذلك، استبدل وعاء النفايات بوعاء تجميع معقم جديد وابدأ في تمرير السائل السلوي عبر مرشح العمق. بعد ذلك، قم بإعداد نظام الترشيح بالجريان المماسي أو نظام TFF في وضعية مفتوحة وقم بتشغيله كما هو موضح في المخطوطة.

عندما يتبقى حوالي 5 mL من السائل في الخزان، أوقف المضخة مؤقتًا وأضف سائل السلى المفلتر بالترشيح العميق إلى الخزان. ثم استأنف تدفق المضخة. ولمنع تمزق الفيروس، من المهم التأكد من أن ضغط النظام لا يتجاوز 10 pound force per square inch.

لزيادة الاستخلاص، يجب استخدام مزيج من سرعة المضخة 연动ية (peristaltic pump) والمشبك C-clamp. عندما يتبقى من 150 إلى 100 ملليلتر من السائل السلوي في الخزان، أوقف المضخة مؤقتًا وقم بتغيير المنظم (buffer) عن طريق إضافة 150 إلى 200 ملليلتر من ML buffer. مرة أخرى، أوقف المضخة مؤقتًا عندما يتبقى من 5 إلى 10 ملليلتر من السائل في الخزان، ثم استخدم مشبكين C-clamp لإغلاق خطوط النفايات.

افصل خط المحتجز (retentate) الذي يغذي الخزان وأدخله في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. بعد ذلك، استأنف التدفق وتوقف عندما تتبقى قطرات قليلة من السائل في خزان الخزان. بعد ذلك، قم بإزالة المشابك C-clamps من خطوط النفايات وأعد توصيل خط تغذية المحتجز بخزان الخزان.

في هذه الأثناء، وللتحضير لعملية الطرد المركزي الفائق بتدرج كثافة الـ iodixanol، أضف أولاً 0.5 milliliters من iodixanol بتركيز 40% إلى أنبوب طرد مركزي فائق رقيق الجدران ومفتوح من الأعلى سعة 13.2 milliliter. ثم قم بتجهيز العمود بإضافات متتالية من 2.5 milliliters من iodixanol بتركيز 20%، و 2.5 milliliters من iodixanol بتركيز 10%. وقبل البدء في عملية الطرد المركزي الفائق، أضف بعناية من ستة إلى 6.5 milliliters من محلول الفيروس المستخلص من نظام TFF إلى عمود الـ iodixanol دون تعكير التدرج.

بعد عملية الطرد المركزي الفائق، قم بإزالة الأنابيب باستخدام ملقط معقم. يجب أن تظهر الحزمة المستهدفة كحزمة كبيرة بين تدرجات 10% و 20%. بعد ذلك، قم بتعليق الأنبوب فوق كأٍس زجاجي باستخدام حامل ريتورت.

بعد ذلك، قم بتثبيت إبرة بمقاس 18 gauge وطول 1.5 بوصة في محقنة سعة خمسة ملليلتر، ثم اثقب جانب أنبوب جهاز الطرد المركزي الفائق (ultracentrifuge) باستخدام الإبرة واستخرج النطاق المستهدف عن طريق سحب المكبس ببطء. بعد إزالة iodixanol من محلول الفيروس كما هو موضح في المخطوطة، استخدم محقنة لحقن الفيروس بعناية في كاسيت دياليز (dialysis cassette). ولتركيز محلول الفيروس، أخرج كاسيت الدياليز من محلول الدياليز وضعه في كيس بلاستيكي صغير قابل للإغلاق.

ثم أضف من 15 إلى 25 milliliters من 40%polyethylene glycol إلى الكيس بحيث تكون كاسيت الديلزة مغمورة بالكامل.