إعادة برمجة خلايا الدم البشرية إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات بوساطة فيروس سينداي

خذ مستنبتًا من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي البشري (PBMCs).

أضف فيروس Sendai الذي يشفر عوامل نسخ إعادة البرمجة. قم بتغطية الطبق وإغلاقه بإحكام.

قم بإجراء الطرد المركزي لتعزيز التلامس بين الفيروس والخلايا، ثم قم بالتحضين.

بعد اندماج الفيروس، يقوم الحمض النووي الريبي (RNA) الفيروسي بالتعبير عن عوامل نسخ تعمل على تنشيط جينات تعدد القدرات الخلوية وتثبيط الجينات المحددة للسلالات لبدء عملية إعادة البرمجة.

خلال هذه الفترة، تتحول مجموعة فرعية من خلايا PBMCs المنقولة إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs) وتعبر عن بروتينات الالتصاق.

انقلها إلى بئر مطلي بمصفوفة (matrix) وقم بطرد الخلايا مركزياً. استبدل الطافي بوسط نمو.

عند الحضن، تلتصق الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) بالمصفوفة، بينما تظل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطية (PBMCs) المنقولة وغير الملتصقة معلقة.

انقل المعلق إلى بئر مطلية وقم بالطرد المركزي. أضف الوسط إلى البئر الأصلية واحضن كليهما.

تبدأ الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) المنقولة المتبقية عملية إعادة البرمجة، وتتحول إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs)، ثم تلتصق. تزيد هذه الخطوة من أقصى قدر من الاحتفاظ بالخلايا المعاد برمجتها.

استبدل الوسط يومياً لدعم نمو iPSC.

في هذا الإجراء، يتم نقل خلايا الدم إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مللتر، وعدّها باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). بعد ذلك، يتم تحضير 3 × 10⁵ من الخلايا لعملية التنحيط (transduction)، وتُطرد الخلايا مركزياً عند 515 × g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، تخلص من الطافي عن طريق الشفط، وأعد تعليق الخلايا في 0.5 milliliters من وسط خلايا الدم. ثم، انقل الخلايا إلى بئر في طبق غير مطلي مكون من 24 بئرًا. أذب خليط فيروس Sendai في الثلج، وأضفه إلى الخلايا المعلقة.

أغلق الطبق باستخدام غشاء إحكام، ثم قم بطرده مركزياً عند 1,150 ×g لمدة 30 دقيقة عند 30 °C. بعد الطرد المركزي، قم بحضن الخلايا عند 37 °C في 5% CO2 طوال الليل. ولطلاء طبق بـ 24 بئراً ببروتين vitronectin، قم في اليوم التالي بتخفيف محلول vitronectin في PBS للحصول على تركيز نهائي قدره 5 µg/ml.

بعد ذلك، أضف 1 مل من vitronectin إلى بئر، واحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك، أزل محلول الطلاء، وانقل جميع الوسائط التي تحتوي على الخلايا والفيروس إلى البئر المطلي. ثم، اجمع الخلايا المتبقية باستخدام 0.5 مل إضافية من وسط خلايا الدم الطازج وأضفها إلى البئر الذي يحتوي على الخلايا.

بعد ذلك، قم بطرد اللوحة مركزياً عند 1,150 ×g لمدة عشر دقائق عند 35 °C، ثم حافظ على الخلايا عند 37 °C في 5% CO2 طوال الليل. ولإجراء عملية نقل الخلايا الثانية، قم بطلاء البئر بـ 5 µg/ml من الـ vitronectin كما تم وصفه سابقاً. استخدم بئراً واحداً من اللوحة لكل عملية نقل جيني، وانقل معلق الخلايا من اللوحة الأولى إلى لوحة الـ vitronectin المطلية حديثاً.

وفي هذه الأثناء، أضف 1 ml من وسط iPSC إلى بئر في اللوحة الأولى من أجل الصيانة، وتحضنها عند 37 °C في 5% CO2، مع تغيير الوسط يومياً باستخدام وسط iPSC طازج. ستظهر المستعمرات في اليوم 14 إلى 21 بعد عملية التنحيط. قم بطرد اللوحة المطلية حديثاً، والتي تحتوي على الخلايا المعلقة، مركزياً عند 1,150 ×g في 35 °C لمدة عشر دقائق.

بعد الطرد المركزي، يتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. وفي اليوم التالي، يتم إزالة السائل الطافي واستبداله بوسط خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات جديد. يتم الحفاظ على الخلايا الملتصقة عن طريق تغيير الوسط يومياً، حتى يتم الوصول إلى نسبة تلاقي تبلغ 80%.