تحليل استدخال فيروس الإنفلونزا باستخدام مقايسة حجب الستريبتاديفين

ابدأ بأنابيب تحتوي على خلايا ظهارية رئوية بشرية.

أضف فيروسات الإنفلونزا المبيوتنة (biotinylated) واحضنها على الثلج. ترتبط الفيروسات بسطح الخلية دون أن يتم إدخالها إلى الداخل.

قم بإجراء عملية الطرد المركزي لفصل الخلايا المرتبطة بالفيروس، ثم تخلص من supernatant وأعد تعليق الخلايا.

في أنبوب النقطة الزمنية الأولية، أضف الستريبتاديفين غير المسمى، الذي يرتبط بالفيروسات المبيوتنة، مكوناً معقدات.

أضف الستريبتفيدين المسمى بفلوروفور، والذي لا يرتبط بمعقد الستريبتفيدين-بيوتين الفيروسي. اغسل الخلايا ثم قم بتثبيتها.

قم بتحضين أنبوب النقطة الزمنية اللاحقة عند درجة حرارة أعلى، مما يسمح بدخول الفيروس إلى داخل الخلايا، ثم أعده إلى الثلج.

أضف الستربتافيدين غير المسمى وعاملاً مانعاً للابتلاع الخلوي، والذي يمنع المزيد من امتصاص الفيروس، ثم قم بالتحضين. يرتبط الستربتافيدين بالفيروسات المبيوتنة المرتبطة بالسطح، ثم قم بالغسل.

قم بتثبيت الخلايا وأضف محلولاً منظماً يحتوي على منظف لجعلها نفاذة.

اغسل ثم أضف streptavidin المسمى بفلوروفور، والذي يدخل إلى الخلايا ويرتبط بـ biotin.

قم بتحليل العينات باستخدام قياس التدفق الخلوي.

يؤكد ارتفاع الفلورة في النقطة الزمنية اللاحقة نجاح عملية الإدخال الخلوي للفيروس.

بعد تكرار عملية الغسيل مرة أخرى، قم بتبريد الأنابيب على الثلج لمدة 10 دقائق. وعندما تبرد الأنابيب، قم بالطرد المركزي مجدداً واستخدم 100 µL من الفيروس الموصوم بالبيوتين والمخفف في PBS العدوى لإعادة تعليق الرواسب بعد التحضين على الثلج لمدة ساعة واحدة، ثم كرر عملية الطرد المركزي والغسيل بـ PBS مرتين، مع معالجة العينات التالية بالتوازي قدر الإمكان بالنسبة لعينات الدقيقة صفر.

لمعالجة عينات الدقيقة صفر مضافاً إليها STV، قم بطرد الأنابيب مركزياً، وأزل السائل الطافي واستخدم 15 µL من STV بتركيز 2% BSA و0.1% sodium azide في PBS لإعادة تعليق كتلة الخلايا. قم بالتحضين على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي واستخدم PBS لغسل الخلايا مرتين بعد التثبيت باستخدام PFA كما تم توضيحه للتو، ثم خزّن العينات عند درجة حرارة 4 °C.

بالنسبة للعينات التي خضعت لفترة 30 دقيقة بالإضافة إلى STV. بعد الترسيب، أعد تعليق العينات في 200 µL من PBS 2% BSA، وذلك بعد تحضينها عند 37 °C لمدة 30 دقيقة.

قم بطرد الخلايا مركزياً ثم أعد تعليقها في 50 microliters من محلول STV 2% BSA 0.1% Sodium azide في PBS، واحضنها على الثلج لمدة 30 دقيقة قبل الغسيل والتثبيت. بعد ذلك، وبعد نفاذية وصبغ جميع العينات باستخدام STV-Cy3، وفقاً للتفاصيل الواردة في البروتوكول النصي، تُخزن العينات في درجة حرارة أربع degrees Celsius. وأخيراً، يتم تحليل العينات بواسطة قياس التدفق الخلوي.