تقييم تثبيط النمو البكتيري بوساطة العاثيات باستخدام قياسات الكثافة الضوئية

ابدأ باستخدام لوح متعدد الآبار يحتوي على معلق عاثيات مخفف تسلسلياً في مرق غني بالمغذيات كمجموعة علاج، ومرق خالٍ من العاثيات كمجموعة ضابطة.

أضف E. coli إلى كل بئر. وباستخدام مقياس الطيف الضوئي، قم بقياس الكثافة الضوئية (OD) المرجعية لتسجيل التركيز البكتيري الأولي.

بعد ذلك، قم بتحضين الطبق للسماح بنمو البكتيريا وإصابتها بالعاثيات.

في مجموعة الضبط، تستهلك البكتيريا العناصر الغذائية وتتكاثر، مما يؤدي إلى زيادة قيمة OD.

في مرحلة المعالجة، ترتبط العاثيات بمستقبلات سطح البكتيريا وتحقن جينوماتها في السيتوبلازم.

باستخدام آليات الخلية المضيفة، يتضاعف الجينوم الفيروسي وينتج بروتينات فيروسية، والتي تتجمع لتكوين جسيمات فيروسية جديدة. تقوم هذه الجسيمات بتحليل الخلية، مما يؤدي إلى إطلاق النسل الفيروسي.

قم بقياس الكثافة الضوئية OD على فترات زمنية محددة لمقارنة النمو البكتيري.

تظهر آبار التحكم زيادة تدريجية في OD، بينما تظهر الآبار المعالجة بالعاثيات قيم OD أقل، مع انخفاضات أكبر عند التركيزات الأعلى من العاثيات.

يساعد هذا في تحديد تركيز العاثيات المطلوب لتحقيق أقصى تثبيط لنمو البكتيريا.

للبدء، يتم إعداد مقايسة الصفيحة الدقيقة باستخدام رؤوس ماصات مرشحة لتجنب التلوث الخلطي. أولاً، أضف 180 µL من mTSB في آبار الأعمدة من 1 إلى 12 في الصفيحة الدقيقة ذات الـ 96 بئراً. ثم قم بإعداد تخفيفات عشرية متسلسلة لكل عاثية في الأعمدة من 1 إلى 8 في الصفائح الدقيقة المعقمة ذات الـ 96 بئراً لتهيئة المقايسة. أضف 20 µL من العاثيات الفردية أو كوكتيلات العاثيات في الآبار من 1 إلى 8 في الصف العلوي A من الصفيحة الدقيقة.

بالنسبة للضابط الخالي من العاثيات والضابط الفارغ، أضف 20 µL من mTSB إلى البئر العلوي في الأعمدة من 9 إلى 12. أثناء عملية النقل بالماصة، اخلط محتويات البئر عن طريق السحب والنفث بلطف وبتكرار خمس مرات على الأقل، مع تغيير الرؤوس بين التخفيفات. اسحب 20 µL من الصف الأخير H، ثم جهّز خزانًا للسلالة البكتيرية المختبرة عن طريق نقل 2 إلى 3 mL من المزرعة المخففة إلى الخزان باستخدام ماصة سعة 1 mL.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 20 µL من المزرعة البكتيرية المخففة إلى كل بئر في الأعمدة من 1 إلى 10 مع تغيير الرؤوس بين كل إضافة. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة وتحضينها عند 37 °C. وبفاصل زمني قدره ساعتان، أخرج الصفيحة الدقيقة من المحضنة واقرأ النتائج باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة.

بدلاً من ذلك، يتم تحضين اللوحة في قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader) وقراءتها بمرور الوقت.