توسيم جينومات فيروس HSV-1 المتضاعفة باستخدام نظير نوكليوزيدي

استخدم مستنبت خلايا ثديية في طور السكون مع حد أدنى من تضاعف DNA، ثم اجمع الوسط المكيف.

أضف فيروس الهربس البسيط (HSV) وحضنه مع الرج من حين لآخر للسماح بارتباط الفيروس. اغسل لإزالة الفيروس غير المرتبط وأعد وسط الزرع المكيّف.

عند التحضين، يندمج الفيروس مع غشاء الخلية المضيفة، مما يؤدي إلى إطلاق القفيصة النووية في السيتوبلازم.

يدخل الـ dsDNA الفيروسي إلى النواة، حيث يتخذ شكلاً حلقياً، ويقوم بالتعبير عن البروتينات الفيروسية من أجل تضاعف الـ DNA الفيروسي.

تعمل البروتينات الفيروسية وبروتينات المضيف على فك التواء الـ DNA الفيروسي وتخليق بادئ RNA. بعد ذلك، يرتبط معقد DNA polymerase الفيروسي بالبادئ ويقوم بتمديده لتخليق الـ DNA.

مع تقدم عملية التضاعف، أضف نظيراً نوكليوزيدياً إلى المزرعة؛ حيث يدخل الخلايا ويتحول إلى شكل ثلاثي الفوسفات.

نظراً لأن تضاعف الحمض النووي للمضيف يكون في حده الأدنى، يتم دمج النظير بشكل تفضيلي في الحمض النووي الفيروسي المتضاعف، مما يؤدي إلى وسم الجينومات الفيروسية.

تصبح الجينومات الفيروسية المميّزة جاهزة للتحليل البروتومي اللاحق للبروتينات المرتبطة بها.

ابدأ هذا الإجراء بزراعة خلايا MRC-5 كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، قم بتخفيف HSV-1 في محلول الملح المنظم بالتريس البارد أو TBS. في الخطوات التالية، من المهم إيقاف تشغيل النافخ وغطاء زراعة الأنسجة لمنع جفاف الخلايا.

استخدم ماصة لنقل وسط النمو من خلايا MRC-5 إلى زجاجة معقمة لإعادة إضافته إلى الخلايا بعد العدوى. قم بإصابة الخلايا عن طريق إضافة سبعة ملليلتر من الفيروس المخفف إلى الخلايا. قم بهز الخلايا كل 10 دقائق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الامتصاص، اسحب اللقاح، واغسل الخلايا بـ 50 milliliters من TBS في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد وسط النمو الأصلي. بعد ذلك، حضن الخلايا عند 37 degrees Celsius في وجود 5% من carbon dioxide. بعد بدء تضاعف DNA الفيروسي، أي بعد حوالي أربع ساعات من العدوى، قم بوسم DNA الفيروسي المتضاعف.

للقيام بذلك، خفف EdC في 1 mL من وسط النمو وأضفه إلى وسط زراعة الخلايا المصابة لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات.