عزل البروتينات من معقدات الحمض النووي الفيروسي والبروتين

خذ نويّات الخلايا التي تحتوي على الجينومات الفيروسية، والموسومة بنيوكليوتيدات معدلة بالألكاين.

قم بتعليق النوى في خليط من البيوتين-أزيد وأيونات النحاس، ثم حضنها.

يساعد أيون النحاس في الربط التساهمي بين مجموعة الأزيد ومجموعة الألكاين.

قم بإجراء الطرد المركزي وتخلص من السائل الطافي.

أعد التعليق في المحلول المنظم، ثم انقل المزيج، وقم بالطرد المركزي لترسيب الراسب.

قم بالتجميد السريع، ثم إذابة الكتلة المترسبة للمساعدة في عملية التحلل.

أعد تعليق العينات واستخدم الموجات فوق الصوتية لتحليل النوى.

قم بإجراء الطرد المركزي وجمع الطافي الذي يحتوي على معقدات البروتين والحمض النووي الفيروسي.

قم بترشيح السائل الطافي لإزالة الملوثات.

قم بتخفيف الرشاحة.

أضف حبيبات مغناطيسية مغلفة بالستربتافيدين وحضن الخليط لتسهيل الارتباط بمعقدات البروتين-DNA المبيوتنة.

قم بتطبيق مجال مغناطيسي لتجميع الخرزات، ثم اغسلها لإزالة الملوثات.

كرر عملية الغسيل.

أضف محلول الاستخلاص وقم بالتسخين لفصل البروتينات ومسخ طبيعتها.

افصل الخرزات، واجمع السائل المستخلص.

قم بالتجميد السريع للبروتينات المعزولة. تُحفظ في درجات حرارة فائقة الانخفاض لإجراء المزيد من التحليلات.

بعد إزالة PBS تماماً، أعِد تعليق الراسب النووي في 10 milliliters من خليط تفاعل click، عن طريق السحب والضخ برفق باستخدام ماصة سعة 10 milliliter لخمس مرات. قم بتدوير العينة لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة four degree celsius، قبل ترسيب النوى كما سبق.

قم بإزالة خليط تفاعل النقرة (click reaction) تماماً، ثم اغسل الراسب عن طريق إعادة تعليقه برفق في 10 milliliters من PBS والطرد المركزي مرة أخرى. الآن، أعد تعليق الراسب النووي بعناية في واحد milliliter من PBS وانقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة PBS تماماً وجمد الراسب تجميداً سريعاً في النيتروجين السائل.

في هذه المرحلة، يمكن تخزين الراسب عند 80 degree celsius أو يمكن الاستمرار في الإجراء. لتحليل النوى وتجزئة الـ DNA، أعد تعليق النوى المذابة في 500 microliters من Buffer B1 عن طريق السحب والضخ بالماصة. قم بتحضين المعلق على الثلج لمدة 45 دقيقة.

بعد ذلك، قم بإجراء السونيكة للعينات ست مرات لمدة 30 ثانية لكل مرة عند سعة 40%، باستخدام مسبار رأس دقيق (microtip probe) بحجم 3 ملم. ضع العينات على الثلج لمدة 30 ثانية على الأقل بين النبضات. بعد السونيكة، يجب أن تظهر العينات شفافة وليست عكرة.

قم بترسيب بقايا الخلايا عن طريق الطرد المركزي بقوة 14,000 x G لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية. يجب أن يقل حجم الراسب بشكل ملحوظ، ثم قم بترشيح السائل الطافي عبر مصفاة خلايا بمقاس 100 ميكرون واحتفظ بالراشح. بعد ذلك، أضف 500 ميكرولتر من Buffer B2 إلى السائل الطافي المُرشح.

لربط الحمض النووي المبيوتن (biotinylated DNA) بالخرزات المطلية بالستريبتوافيدين، قم بتحضير خرزات الستريبتوافيدين المغناطيسية عن طريق نقل 300 µL من ملاط الخرزات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL. قم بتحضير أنبوب واحد من الخرزات لكل عينة. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 1 mL من Buffer B2 عن طريق الرج الدوامي (vortexing) لإعادة التعليق، ثم وضعها على مغناطيس لفصل الخرزات وسحب محلول الغسل.

بعد ذلك، أضف 900 µL من العينة إلى الخرزات المغسولة. وسيتم استخدام المتبقي من العينة لعزل الـ DNA والبروتين المدخلين (input). يتم تدوير المعلق طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

في اليوم التالي، ضع العينات في حامل أنابيب طرد مركزي مغناطيسي وقم بإزالة السائل الطافي. أعد تعليق الخرزات برفق في 1 mL من Buffer B2، قبل تدويرها عند 4 °C لمدة خمس دقائق. قم بإزالة السائل الطافي مرة أخرى باستخدام حامل أنابيب الطرد المركزي المغناطيسي.

هذه المرة، أعد تعليق الخرزات برفق في واحد مليلتر من Buffer B3 وقم بتدويرها عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق. بعد إزالة supernatant من خليط الخرزات باستخدام المغناطيس، أعد تعليق الخرزات في 50 µL من 2x Laemmli sample buffer لاستخلاص معقدات البروتين والحمض النووي DNA. بعد ذلك، قم بغلي العينات عند درجة حرارة 95 °C لمدة 15 دقيقة.

قم برج المزيج باستخدام جهاز الـ Vortex قبل طرد العينات سريعاً في جهاز طرد مركزي دقيق (microfuge). ضع العينات على المغناطيس وانقل الراشح إلى أنبوب جديد. وأخيراً، قم بتجميد العينات سريعاً (flash freeze) واحفظها عند 80 degrees celsius.

قم بإجراء تحليل البروتين كما هو موضح في البروتوكول النصي.