جهاز مطلي بالسيليكون مطبوع ثلاثي الأبعاد لنمذجة عدوى المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة

خذ طبقا متعدد الآبار يحتوي على بول بشري معقم.

تلقيح آبار الاختبار بالبكتيريا. تحتوي آبار التحكم على البول وحده.

خذ جهازا مطبوعا ثلاثي الأبعاد ومغطى بالسيليكون يحاكي السطح الداخلي للقسطرة ، حيث تتطور الأغشية الحيوية أثناء التهابات المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة.

ضعه في الآبار وأغلق الطبق واحتضنه.

تلتصق البكتيريا بسطح الجهاز ، وتستخدم العناصر الغذائية من البول ، وتشكل أغشية حيوية.

اشطف الجهاز بمخزن مؤقت لإزالة البكتيريا غير المرتبطة.

ضع الجهاز في صفيحة متعددة الآبار تحتوي على البنفسج الكريستالي ، والذي يتفاعل مع الأغشية الحيوية لتلطيخه.

اشطفها بالماء وجففها.

اغمر الجهاز في صفيحة متعددة الآبار تحتوي على محلول حمضي لتعطيل تفاعلات الصبغة والأغشية الحيوية وإطلاق الصبغة في المحلول.

قم بقياس امتصاص المحاليل في كل بئر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

يؤكد الامتصاص العالي في آبار الاختبار مقارنة بآبار التحكم تكوين الأغشية الحيوية على الجهاز ، مما يشير إلى ملاءمته لنمذجة عدوى المسالك البولية المرتبطة بالقسطرة.

للبدء ، احصل على عينة بول بشري مجمعة. أليكوت 135 ميكرولتر من البول البشري المجمع في كل بئر قيد الاختبار لصفيحة مكونة من 96 بئرا باتباع التصميم المحدد.

قم بتلقيح كل بئر قيد الاختبار ب 15 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية الطبيعية بين عشية وضحاها لتحقيق حجم نهائي يبلغ 150 ميكرولتر لكل بئر. احتفظ بما لا يقل عن 100 ميكرولتر من هذه الثقافة لخطوات التحقق من صحة التخفيف التسلسلي اللاحقة.

قم بإعداد آبار التحكم السلبية عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من البول البشري المعقم إلى الآبار المخصصة.

الآن ، أدخل الأوتاد في الآبار المقابلة لها. اضغط على غطاء الوتد لأسفل حتى يجلس متدفقا على اللوحة وثبته بغطاء اللوحة الدقيقة ، وقم بتثبيته لأسفل إذا لزم الأمر.

ثم ضع نماذج الوتد في حوض بلاستيكي محكم الغلق أو كيس يحتوي على لفافة زرقاء رطبة لمنع التبخر. احتضان ثابتا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.

للتحقق من صحة اللقاح ، قم بتقسيم 180 ميكرولتر من PBS في الصفوف من 2 إلى 6 من العمود الأول من صفيحة مكونة من 96 بئرا قبل إضافة الثقافة المحجوزة.

الآن ، انقل 20 ميكرولتر من البئر الأول إلى البئر الثاني ، واخلطه برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. استمر في التخفيف التسلسلي حتى يتم تخفيف اللقاح الأولي إلى البئر النهائي.

بعد ذلك ، قم بوضع 10 بقع ميكرولتر من كل تخفيف على وسائط صلبة مناسبة في ثلاث نسخ. بعد الحضانة طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، عد المستعمرات من كل بقعة.

لقياس الأغشية الحيوية ، قم بإزالة نموذج الوتد من الصفيحة الدقيقة واقلبها تحت اللهب أو داخل خزانة أمان ميكروبيولوجية ، مع توجيه الأوتاد لأعلى. تخلص من الألواح الدقيقة المستخدمة.

انقل غطاء الوتد إلى صفيحة دقيقة جديدة تحتوي على 180 ميكرولتر من PBS المعقمة لشطف الخلايا غير الملتصقة.

بعد ذلك ، عند العمل بشكل متسيب ، ضع رفا معقما لأنبوب الاختبار الزجاجي على المقعد وقم بتوصيل الجزء العلوي من الرف المناسب الذي يحمل غطاء الوتد.

باستخدام ماصة صغيرة ، قم بإدخال 600 ميكرولتر من PBS المعقم في كل أنبوب اختبار. الآن ، أدخل غطاء الوتد في الحامل ، وتأكد من محاذاة الأوتاد مع أنابيب الاختبار. قم بإزالة أي شريط أوتوكلاف من الغطاء.

استخدم ملقطا معقما لدفع كل ربط عبر الغطاء إلى أنابيب الاختبار الموجودة أسفل مباشرة. ثم استبدل أغطية أنبوب الاختبار ودوامة كل أنبوب لمدة 60 ثانية لإزاحة الخلايا المرتبطة بالأغشية الحيوية.

قم بإزالة 100 ميكرولتر من كل أنبوب دوامي وقم بإجراء تخفيفات تسلسلية في PBS المعقم كما هو الحال سابقا.

لتلطيخ الخلايا باللون البنفسجي الكريستالي، قم بماصة 180 ميكرولتر بوزن 0.1 بالمائة لكل حجم بنفسجي بلوري في ماء مقطر معقم في 24 بئرا قيد الاختبار للوحة مكونة من 96 بئرا. أدخل نموذج الوتد المغسول في الآبار المقابلة واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

بعد التلوين ، قم بإزالة نموذج الوتد من اللوحة وتخلص من اللوحة المستخدمة. في حوض نظيف ، اشطف نموذج الوتد بالكامل في ماء الصنبور الجاري مع تحريك لطيف.

بعد 2 غسلة أخرى ، اقلب نموذج الوتد واتركه يجف تماما في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 180 ميكرولتر من حمض الأسيتيك بنسبة 30٪ إلى طبق جديد بسعة 96 بئرا. أدخل نموذج الوتد المجفف في الآبار المقابلة.

عند اكتمال الحضانة ، قم بإزالة نموذج الوتد من الصفيحة الدقيقة. قم بقياس الكثافة البصرية للآبار الملطخة عند 540 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة أو مقياس الطيف الضوئي.