تنقية النواقل الغدانية المحتوية على الجينوم باستخدام كلوريد السيزيوم

ابدأ باستخدام خلايا ثديية مصابة بفيروس غدي.

قم بإجراء دورات متكررة من التجميد والإذابة لتحليل الخلايا وتحرير الفيريونات.

قم بطرد المستخلص مركزياً لترسيب الحطام. اجمع الراشح الذي يحتوي على الجسيمات الفيروسية.

ضع الطافي الفيروسي فوق تدرج كلوريد السيزيوم المتدرج للفصل بناءً على الكثافة.

جهاز طرد مركزي فائق للسماح للجسيمات الفيروسية بالهجرة وفقاً لكثافاتها الطافية.

تكون الفيريونات السليمة التي تحتوي على الجينوم الفيروسي الغددي الكامل أكثر كثافة بسبب الحمض النووي DNA المعبأ، لذا فهي تترسب في حزمة سفلية، بينما تظل القفيصات الفارغة والأخلاط الأخف وزناً في الطبقات العليا.

قم بإزالة الطبقات العليا. ثم اجمع النطاق السفلي من الفيريونات المحتوية على الجينوم.

أعد تعليق الفيريونات في كلوريد السيزيوم ذي الكثافة الموحدة ثم قم بإجراء الطرد المركزي الفائق مرة أخرى لتحسين عملية الفصل وتركيز الجسيمات الكاملة.

تخلص من الطبقات العليا واستخلص النطاق السفلي.

قم بإجراء الديلزة للعينة لإزالة كلوريد السيزيوم.

أصبحت النواقل الغدية عالية النقاء والمحتوية على الجينوم الآن جاهزة للتطبيقات اللاحقة.

لتحضير محلل الفيروس من أجل التنقية باستخدام تدرج كلوريد السيزيوم، قم بتجميد وإذابة معلق الخلايا الفيروسي أربع مرات. بعد ذلك، قم بطرد محلل الفيروس مركزياً عند 500 ×g لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، اجمع الطافي الذي يحتوي على الفيروس الغداني عالي السعة. باستخدام الماصة، أضف محاليل كلوريد السيزيوم بعناية وببطء إلى الأنابيب بالترتيب التالي: 0.5 milliliters من محلول بتركيز 1.5 grams per cubic centimeter، و3 milliliters من محلول بتركيز 1.35 grams per cubic centimeter، و3.5 milliliters من محلول بتركيز 1.25 grams per cubic centimeter. ثم ضع حوالي 4.5 milliliters من الطافي المصفى للناقل فوق طبقة 1.25 grams per cubic centimeter.

قم بطرد التدرجات مركزياً في جهاز طرد مركزي فائق باستخدام دوار متأرجح عند درجة حرارة 12 degrees Celsius لمدة ساعتين على الأقل وبقوة 226,000 times g لفصل الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على جينوم الفيروس الغدي عالي السعة عن الجسيمات الفارغة وبقايا الخلايا. بعد عملية الطرد المركزي، تتشكل حزمة منتشرة من بقايا الخلايا في الجزء العلوي من الأنابيب، ويمكن ملاحظة حزمتين بيضاويتين أسفلها.

تحتوي الحزمة العلوية على جسيمات فارغة، بينما تمثل الحزمة السفلية الفيروس الغدي عالي السعة. قم بإزالة طبقات الحطام الخلوي والجسيمات الفارغة بعناية. بعد ذلك، اجمع 1 mL من الحزم السفلية من كل أنبوب.

انقل الفيروس إلى أنبوب معقم سعة 50 milliliter. أضف ما يصل إلى 24 milliliters من محلول كلوريد السيزيوم بتركيز 1.35 grams per cubic centimeter إلى جزيئات الفيروس المجمعة وامزجها بعناية. املأ أنابيب الطرد المركزي حتى الأعلى بمحلول الفيروس وكلوريد السيزيوم بتركيز 1.35 grams per cubic centimeter.

ثم يتم الطرد المركزي طوال الليل بسرعة 226,000 ×g عند درجة حرارة 12 درجة مئوية في جهاز طرد مركزي فائق باستخدام دوار متأرجح مع تسريع وتباطؤ بطيئين. تُزال الطبقات العليا من الأعلى باستخدام ماصة. بعد ذلك، يتم جمع الفيروس الغدي عالي السعة الموجود في النطاق السفلي البارز باستخدام طرف ماصة جديد.

أخيرًا، قم بإجراء الديلزة لجزيئات الفيروس التي تم جمعها لاستبدال المنظم. ومن ثم، قم بتعيين عيار التحضير النهائي وفقًا للتعليمات المفصلة الواردة في البروتوكول المكتوب.