تأكيد ترنسدكشن الفيروس في كبد جرذ مُعاد استزراعه باستخدام الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي

ابدأ بنسيج كبد جرذ مُعاد تكوينه ومجمد، يحتوي على خلايا كبدية بشرية، ومغمور في وسط تجميد.

في هذا النسيج، تعبر الخلايا الكبدية التي تم نقل الجينات إليها عن البروتين الفلوري الأخضر الزمردي (EmGFP)، وهو بروتين مراسل مشفر بواسطة الناقل الفيروسي.

استخدم المقطاع بالتجميد (cryotome) لقطع مقاطع رقيقة تحافظ على البنية الخلوية والنسيجية. انقل هذه المقاطع إلى شريحة.

عالج المقاطع باستخدام منظف خفيف لنفاذية الغشاء الخلوي.

قم بتطبيق جسم مضاد أولي مضاد لـ EmGFP يرتبط خصيصاً ببروتين المراسل الفلوري الذي تم التعبير عنه في الخلايا التي خضعت لعملية نقل الجينات.

يُغسل لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.

أضف جسماً مضاداً ثانوياً مقترناً بفلوروفور أحمر، يرتبط بالجسم المضاد الأولي، ثم قم بالغسل.

أضف صبغة فلورية زرقاء متخصصة في DNA ترتبط بالـ DNA الخلوي.

تحت المجهر الفلوري، يؤكد التوضع المشترك للفلورة الحمراء مع النوى المصبوغة باللون الأزرق أن الخلايا الكبدية التي تم نقل الجين إليها في نسيج الكبد تعبر بنجاح عن البروتين المراسِل الفيروسي.

باستخدام مشرط، يتم قطع عينات من كل فص من فصوص الكبد بسمك نصف سنتيمتر تقريبًا وطول يتراوح بين 1.5 إلى 2 سنتيمتر. تُحضن الشرائح في محلول 4% paraformaldehyde مع 4% sucrose لمدة 90 دقيقة عند 4 °C.

ثم اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة دقيقة واحدة في كل غسلة. اتبع عمليات الغسل بتحضين العينات طوال الليل في محلول سكروز 8% عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، ضع العينات في قوالب التجميد التي تحتوي على بعض وسط التثبيت.

تجنب إدخال أي فقاعات هوائية. وبمجرد وضع العينات، قم بتغطيتها بالكامل بوسط التثبيت واحفظها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. وبعد تجميدها، قم بتحضير مقاطع تجميدية بسمك 10 ميكرون من العينات باستخدام جهاز المقطاع بالتجميد (cryotome).

قم بصبغ العينات حسب الحاجة لتأكيد إعادة التخليق الخلوي.