توليد خلايا ذات تثبيط جيني شرطي باستخدام نظام تعبير shRNA لفيروسي بطيء مستجيب للتتراسيكلين

خذ مزرعة خلايا بشرية.

أضف الفيروسات البطيئة (lentiviruses) التي تشفر shRNA يستهدف mRNA المضيف بشكل شرطي، تحت تحكم محفز يستجيب للتتراسيكلين ومندمج مع مشغّل (operator).

كما يحمل الفيروس البطيء جينات لبروتين كابت للتتراسيكلين وبروتين مقاوم للمضادات الحيوية، موضوعة تحت تحكم محفز بنيوي.

يتم التحضين للسماح بدخول RNA الفيروسي إلى الخلايا المضيفة.

يتحول الـ RNA إلى cDNA ويندمج في جينوم المضيف.

اغسل الخلايا، ثم أضف الوسط الغذائي وحضنها للسماح بالتعبير عن كابت التتراسيكلين وبروتين مقاومة المضاد الحيوي، مما يؤدي إلى إنتاج خلايا مُنقولة جينياً. يرتبط كابت التتراسيكلين بالمُشغل ويثبط التعبير عن shRNA.

اغسل الخلايا، ثم أضف الأوساط الغذائية المدعمة بالمضادات الحيوية واحضنها.

تعبّر الخلايا المنقولة جينياً عن بروتين مقاومة المضاد الحيوي، مما يتيح بقاءها بشكل انتقائي في وجود المضاد الحيوي.

أضف الدوكسيسيكلين، وهو نظير للتتراسيكلين، إلى المزرعة.

يرتبط الـ Doxycycline بالكابت التتراسيكلين، مما يمنع ارتباطه بالمشغل ويسمح بالتعبير عن shRNA.

تتم معالجة shRNA وتحويلها إلى siRNA، والتي يتم تحميلها في معقد RISC لتعمل على تفكيك mRNA المستهدف.

يؤدي ذلك إلى إنتاج خلايا ذات تثبيط جيني شرطي يعتمد على الدوكسيسيكلين.

لإنشاء خطوط خلوية مستقرة، ابدأ ببذر خلايا سرطان القولون HCT-116 وخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 في طبق ذو 12 بئراً وبكثافة 50,000 خلية لكل بئر.

يُحضن المزيج عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون. وعندما تصل الخلايا إلى درجة تلاقي بنسبة 60-70%، تُغسل الخلايا باستخدام PBS ويُضاف 1 mL من الوسط المحتوي على الفيروس إلى كل بئر. وفي اليوم التالي، يُزال الوسط المحتوي على الفيروس بعناية عن طريق الشفط.

ثم بعد غسل الخلايا بمحلول PBS، أضف وسطاً يحتوي على FBS خالٍ من التتراسيكلين. وبعد 72 ساعة، اغسل الخلايا كما سبق وأضف وسطاً مدعماً بـ 1 µg/mL من البوروميسين لاختيار الخلايا التي تم نقل الفيروس إليها. يتم اختيار الخلايا المنقول إليها الفيروس عن طريق زراعة الخلايا في وجود البوروميسين لمدة تتراوح من 3 إلى 14 يوماً.

لاحظ القتل الجزئي للخلايا بواسطة puromycin في الآبار التي تحتوي على خلايا محولة بالفيروس. لن تنمو الخلايا غير المحولة في وجود puromycin.

تحقق من كفاءة التعطيل الشرطي (conditional knockdown) في خلايا سرطان القولون HCT-116 وخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 المقاومة للبوروميسين، وذلك بإضافة وسط يحتوي على تركيزات مختلفة من الدوكسيسيكلين وزراعة الخلايا لمدة 72 ساعة.