JoVE Encyclopedia of Experiments
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدات • 3:51 د • August 31st, 2026
استخدم ناقلات فيروسية بطيئة (lentiviral vectors) تحتوي على مستضد HIV-1 p24، وهو بروتين مؤشر يُستخدم للكشف.
أضف مادة منظفة لتحلل وتحرر p24، ثم قم بتخفيف العينة تسلسلياً.
استخدم لوحة ميكروية مطلية بأجسام مضادة أحادية النسيلة ضد p24 وعامل حجب لمنع الارتباط غير النوعي.
أضف تخفيفات العينات ومعايير p24 كمرجعيات.
يتم التحضين للسماح بتفاعل p24 مع الأجسام المضادة عبر إبيتوپ محدد، ثم تُزال المكونات غير المرتبطة.
يُحضن باستخدام أجسام مضادة متعددة النسائل لـ anti-p24 ترتبط بمواقع إيبيتوب مختلفة على p24. ثم تُزال أي أجسام مضادة غير مرتبطة.
أضف الأجسام المضادة المرتبطة بإنزيم البيروكسيديز والتي ترتبط بالأجسام المضادة متعددة النسيلة. ثم تخلص من الأجسام المضادة غير المرتبطة.
أضف ركيزة بيروكسيداز تتحول إلى منتج ملون.
أضف حمضاً لإيقاف نشاط البيروكسيديز وتثبيت الناتج.
قس الامتصاصية المقابلة لكثافة اللون، والتي تتناسب طردياً مع تركيز p24.
قم بإنشاء الرسم البياني القياسي وتقدير تركيزات العينات لتحديد العيار الفيروسي.
قم بتغطية لوحة ذات 96 بئراً عالية الارتباط بـ 10 µL من الأجسام المضادة أحادية النسيلة anti-p24 بتخفيف 1:150 وفقاً لبرنامج لقاح الإيدز التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) الخاص بطقم مقايسة التقاط مستضد HIV-1 p24. قم بتحضين اللوحة طوال الليل عند 4 °C. وفي اليوم التالي، اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام 20 µL من 0.05% TWEEN-20 في PBS بارد.
لتجنب الارتباط غير النوعي، قم بحجب اللوحة باستخدام 20 microliters من bovine serum albumin بتركيز 1% لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل اللوحة بـ 20 microliters من TWEEN-20 بتركيز 0.05% في PBS بارد ثلاث مرات. ثم، قم بتحضير عينات الناقل المركزة وغير المركزة بتركيز نهائي قدره 10% عن طريق تخفيف الناقل باستخدام ماء مقطر مزدوج وTriton X-10.
بعد ذلك، قم بتحضير معايير HIV-1 باستخدام تخفيف تسلسلي بمقدار ضعفين بدءاً من تركيز 5 ng/mL. وبعد تخفيف عينات الناقل المركزة وغير المركزة، انقلها بالماصة إلى الطبق في ثلاث مكررات واحضنها عند 4 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، اغسل الطبق، ثم أضف 10 µL من الجسم المضاد متعدد النسائل للأرنب المضاد لـ p24 إلى كل طبق واحضنه عند 37 °C لمدة أربع ساعات.
بعد ست غسلات، يتم تحضين الطبق مع goat anti-rabbit horseradish peroxidase عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. وبعد غسلات متعددة، يتم تحضين الطبق مع TMB peroxidase substrate في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف حمض الهيدروكلوريك بتركيز 1 N لإيقاف التفاعل، ثم اقرأ الامتصاصية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ امتصاصية الأطباق.