إنتاج الفيروس المرتبط بالغدة مأساوي المؤتلف عن طريق ترانسفكشن البلازميد

ابدأ بمزيج من البلازميدات المعلقة في وسط مغذٍ.

يحمل البلازميد الأول جينوم الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) المؤتلف الذي يشفر الجين المستهدف.

يشفر البلازميد الثاني بروتينات Rep وCap.

يُشفر البلازميد الثالث البروتينات المساعدة.

أضف عامل ترنسفكشن (transfection agent) إلى محلول البلازميد. اخلط جيداً ثم قم بالتحضين.

يرتبط عامل التعداء ذو الشحنة الموجبة بالحمض النووي البلازميدي ذو الشحنة السالبة، مما يؤدي إلى تكوين معقدات.

أضف المعقدات إلى طبقة أحادية من خلايا ثديية. ثم قم بالتحضين.

تدخل المعقدات إلى الخلايا عبر عملية الالتقام الخلوي.

داخل الخلايا، تعمل الجينات المشفرة في البلازميد على تحفيز تعبير البروتينات الفيروسية.

يعمل بروتين Rep على نسخ الجينوم الفيروسي، بينما تشكل بروتينات Cap أغلفة الكبسيدة.

يقوم بروتين Rep، بالتعاون مع البروتينات المساعدة، بتعبئة الجينوم الفيروسي المتضاعف داخل الكبسيدات، مما يؤدي إلى تكوين جسيمات AAV كاملة.

أصبحت نواقل AAV المؤشبة التي تحمل الجين المستهدف جاهزة لتطبيقات نقل الجينات.

بعد إنشاء بنى rAAV9 وزراعة خلايا HEK293 وفقاً للبروتوكول المكتوب، ومن أجل إجراء عفن الخلايا في اليوم الأول، اخلط 70 micrograms من بلازميد AAV Rep-Cap، و70 micrograms من بلازميد rAAV9، و20 micrograms من بلازميد Ad helper في أنبوب طرد مركزي سعة 50-milliliter. أضف 49 milliliters من وسط DMEM بدرجة حرارة الغرفة وبدون FBS إلى الأنبوب واخلط جيداً. بعد ذلك، ولتحضير محلول PEI إلى DNA بنسبة أربعة إلى واحد، أضف 1,360 microliters من PEI إلى الأنبوب واخلط جيداً.

يُحضن المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة. بعد فترة التحضين، يُضاف 5 مل من المحلول إلى كل طبق خلايا بحجم 150 ملل. تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 °C و 5% CO₂ لمدة تتراوح من 50 إلى 72 ساعة.