تنقية جزيئات الفيروس المعاد تركيبه من خلايا الكلى البشرية المنقولة جينياً

ابدأ بمحلول تحلل خلوي يحتوي على DNA خلوي متجمع مع البروتينات الخلوية والجسيمات الفيروسية.

أضف أيونات المغنيسيوم، متبوعة بإنزيم النيوكليز، لتنشيط التحلل الإنزيمي للحمض النووي الخلوي وتفكيك تجمعات الحمض النووي والبروتين.

قم بالطرد المركزي لفصل الحطام وجمع السائل الطافي الذي يحتوي على الجسيمات الفيروسية.

ضع السائل الطافي فوق تدرج iodixanol غير متصل تزداد تركيزاته من الأعلى إلى الأسفل، ثم املأ الأنبوب بالمحلول المنظم.

جهاز طرد مركزي فائق لفصل المكونات بناءً على الكثافة. تتراكم الجسيمات الفيروسية عند السطح الفاصل بين الطبقتين ذاتي الكثافة العالية والمتوسطة.

أدخل إبرة عند هذه الواجهة واجمع الجسيمات الفيروسية في أنبوب.

أضف محلولاً منظماً يحتوي على مكونات تثبيت، مما يمنع تكتل الجسيمات الفيروسية.

ثم انقل المحلول إلى أنبوب يحتوي على مرشح غشائي.

قم بإجراء الطرد المركزي لتركيز الجسيمات الفيروسية فوق المرشح.

أضف المنظم المكمل بعامل التثبيت ثم قم بالطرد المركزي مجددًا للحصول على جسيمات فيروسية منقاة.

لجمع الخلايا المنقولة، قم بفصل الخلايا وتعليقها باستخدام وسط الزرع عن طريق السحب والتفريغ بالماصة. ثم انقل معلقات الخلايا إلى أنابيب معقمة سعة 50-milliliter. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 500 times g لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، أضف خمسة ملليلتر من PBS إلى كل أنبوب وأعد تعليق رواسب الخلايا قبل دمج جميع المعلقات في أنبوب واحد سعة 50 ملليلتر. وبعد طرد الخلايا مركزياً عند 500 ×g لمدة خمس دقائق، تخلص من supernatant. ولتنقية AAV، أعد تعليق الرواسب في 10 ملليلتر من lysis buffer.

قم بتجميد المستخلص عند درجة حرارة 80- درجة مئوية أو في حمام من الثلج الجاف والإيثانول. ثم قم بإذابته عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. قم برج المستخلص باستخدام جهاز vortext لمدة دقيقة واحدة قبل تكرار عمليتي التجميد والإذابة مرتين إضافيتين.

بعد ذلك، أضف كلوريد المغنيسيوم بتركيز 1 millimolar إلى المستخلص الخلوي المذاب. ثم أضف النوكلياز ليصل إلى تركيز نهائي قدره 250 units per milliliter. حضّن المحلول عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة 15 دقيقة لإذابة تجمعات البروتين والحمض النووي DNA.

قم بطرد العينة مركزياً عند 4,800 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة، ثم اجمع الطافي. وفي هذه الأثناء، لتحضير محلول تدرج iodixanol بتركيز 17%، اخلط 5 mL من 10X PBS مع 0.05 mL من magnesium chloride بتركيز 1 M، و0.125 mL من potassium chloride بتركيز 1 M، و10 mL من sodium chloride بتركيز 5 M، و12.5 mL من وسط تدرج الكثافة.

استخدم الماء لضبط الحجم الإجمالي إلى 50 milliliters. بعد تحضير محاليل التدرج بتركيزات 25% و40% و60% وفقاً للبروتوكول المكتوب، استخدم إبرة ومحقنة لتحميل خمسة milliliters من محلول التدرج بتركيز 17% في أنبوب بولي بروبيلين. اتبع ذلك بتحميل خمسة milliliters من كل من محاليل التدرج بتركيزات 25% و40% و60% على التوالي.

ضع المستخلص فوق التدرج. ثم املأ الأنبوب بمحلول التحلل وقم بتغطيته بسدادة فلينية. قم بطرد التدرج مركزياً عند 185,000 ×g ودرجة حرارة 16 °C لمدة 90 دقيقة.

بعد عملية الطرد المركزي، استخدم حقنة لجمع الجزء الفيروسي بنسبة 40% عن طريق إدخال إبرة قياس 21 في نقطة التقاطع بين الجزأين بنسبة 40% و60%، مع تجنب الطبقة بنسبة 25% تماماً. اخلط الجزء الفيروسي مع محلول polyoxyethylene polyoxypropylene المعقم، أو محلول PBS المكون من بوليمر إسهامي كتلوي PEG-PPG، حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 15 milliliters. ضع الخليط في أنبوب ترشيح بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 100 kilodaltons.

ثم قم بطرد العينة مركزياً عند 2,000 times g ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بسكب المحلول من قاع الأنبوب. بعد ذلك، استخدم PEG-PPG لإعادة ملء أنبوب الترشيح حتى 15 milliliters.

قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 2,000 ×g ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. وبعد تكرار عمليتي إعادة الملء والدوران مرتين إضافيتين، اجمع جزء فيروس rAAV9 المنقى الموجود فوق المرشح.