تخليد الخلايا البطانية عبر نقل جينات ورمية فيروسية بواسطة الفيروسات القهقرية

استخدم وسطاً يحتوي على جزيئات فيروسات قهقرية تُشفر الجينات الورمية الفيروسية وجيناً لمقاومة المضادات الحيوية.

قم بطرد الوسط مركزياً لإزالة حطام الخلايا.

اجمع الطافي الذي يحتوي على الجزيئات الفيروسية وقم بإضافته فوق مزرعة من الخلايا البطانية.

يتم التحضين للسماح بدخول الفيروس.

يتم نسخ الحمض النووي الريبي (RNA) الفيروسي عكسياً إلى حمض نووي ريبي منقوص الأكسجين (DNA)، والذي يندمج بدوره في جينوم المضيف.

ينتج جين مقاومة المضادات الحيوية بروتيناً مقاوماً. أما الجينات المسرطنة فتنتج بروتينات ترتبط ببروتينات كابتة للأورام التي تتحكم في انقسام الخلايا وتعمل على تثبيطها، مما يؤدي إلى إطالة عمر الخلية.

استبدل الوسط بوسط جديد.

يُحضن مرة أخرى لضمان التكامل المستقر للحمض النووي الفيروسي.

أزل الوسط الغذائي واغسل الخلايا.

أضف محلول تفكيك إنزيمي لفصل الخلايا.

انقل معلق الخلايا، ثم قم بالطرد المركزي، وأزل الطافي.

أعد تعليق الراسب وانقله إلى قارورة.

أضف مضاداً حيوياً إلى الوسط.

تنجو فقط الخلايا التي تعبّر عن بروتين مقاومة المضادات الحيوية، مما يؤدي إلى اختيار الخلايا التي تم تخليدها بواسطة بروتينات الجينات الورمية الفيروسية.

بعد تحضين الخلايا طوال الليل، يتم جمع الوسط من مستنبت خلايا PA317 وتصفيته عن طريق الطرد المركزي عند 300 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استبدل وسط EGM من مستنبت الخلايا البطانية ذات الاندماج بنسبة 50% بـ 12 milliliters من وسط PA317 المصفى. ثم حضّن الخلايا لمدة أربع ساعات.

بعد ذلك، استبدل 6 mL من وسط PA317 بـ 6 mL من وسط EGM الطازج واحضن الخلايا طوال الليل. بعد ذلك، قم بإزالة الوسط من مزرعة الخلايا البطانية وغذِّ الخلايا بـ 12 mL من وسط EGM الطازج. استمر في حضن الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية.

لإجراء استزراع فرعي للخلايا البطانية، يتم إزالة الوسط وغسل الخلايا بـ 12 mL من محلول PBS الخالي من الكاتيونات. ثم يُضاف 3 mL من محلول تفكيك إنزيمي تجاري وتُحضن الخلايا عند 37 °C لمدة ثلاث دقائق. يتم نقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL وطرد الخلايا مركزياً عند 300 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد تجميع الخلايا في كريّة، أعد تعليقها في وسط EGM طازج وقسم المعلق بالتساوي على ثلاث دوارق T75. اضبط حجم المزارع ليكون 12 milliliters من EGM لكل دورق. ثم أضف 200 micrograms لكل milliliter من G418 لاختيار الخلايا البطانية التي تم نقل الجينات إليها.