موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدة • 4:23 دقيقة • August 31st, 2026
ابدأ بشريحة تحتوي على خلايا مضيفة مصابة بالفيروس ونفوذة، حيث تتوزع الرنا الفيروسية (viral RNAs) بين الحيزين النووي والسيتوبلازمي.
أضف محلولاً منظماً لما قبل التهجين واتركه في حضانة تحت ظروف رطبة.
في المحلول المنظم، تعمل كواشف الحجب على سد مواقع الارتباط غير النوعية، بينما تعمل مثبطات RNase على تعطيل إنزيمات RNases والحفاظ على سلامة RNA.
أزل المحلول المنظم وأضف مجسات قليلة النوكليوتيدات ذات علامة ديجوكسيجين ممسوخة ومكملة للحمض النووي الريبي الفيروسي (viral RNA).
يُحضن في الظلام للسماح بتهجين المسبار مع الـ RNA، ثم يُغسل بشكل متكرر.
أضف مادة مثبتة لاستقرار هجائن المسبار-RNA، ثم اغسل العينات بشكل متكرر. أضف محلولاً منظماً مدعوماً بمنظف للحفاظ على نفاذية الخلايا.
أضف جسماً مضاداً لـ digoxigenin مقترناً بفلوروفور أخضر يتفاعل مع digoxigenin، ثم اغسل عدة مرات.
قم بتثبيت الخلايا للحفاظ على المعقدات، ثم اغسلها مرة أخرى.
أضف صبغة مرتبطة بالـ DNA لتلوين النوى. اغسل الصبغة الزائدة بشكل متكرر.
قم بالتثبيت باستخدام شريحة غطاء وإغلاقها بإحكام.
باستخدام مجهر كنفوكال، قم بتصوير الفلورة الخضراء، والتي تعكس توزيع الـ RNA الفيروسي بين نواة الخلية المضيفة والسيتوبلازم.
بعد إجراء ثلاث غسلات بمحلول PBS كما هو موضح، قم بتثبيت العينات مرة أخرى في 4% formaldehyde في PBS لمدة 10-15 دقيقة قبل القيام بعملية نفاذية ثانية كما هو موضح. ثم غطِّ الشريحة بورق ألومنيوم للحفاظ على الإشارة الفلورية ومنع التبييض الضوئي.
اغسل الخلايا بمحلول سترات الصوديوم الملحية (2x saline sodium citrate)، قبل إضافة 45 µL من محلول التهجين. وبعد مرور ساعة واحدة عند 37 °C في غرفة رطبة، أضف الماء المقطر إلى قليلات النيوكليوتيد المضادة للحس (antisense oligonucleotides) المطلوبة لجعل حجم عملية المسخ 10 µL. قم بمسخ قليلات النيوكليوتيد عند 95 °C لمدة خمس دقائق، قبل إضافة 35 µL من محلول تهجين جديد لكل شريحة.
ثم يتم تحضين العينات لمدة تتراوح من 10-24 ساعة في غرفة رطبة عند 37 درجة Celsius، مع حمايتها بورق القصدير. وفي اليوم التالي، تُغسل الخلايا مرتين لمدة 10 دقائق لكل غسلة باستخدام محلول saline sodium citrate بتركيز 2X في درجة حرارة الغرفة، يليه غسلة واحدة في محلول saline sodium citrate بتركيز 1X لمدة 10 دقائق، عند 25 درجة Celsius.
بعد الغسلة الأخيرة، يتم تثبيت الخلايا باستخدام 4% formaldehyde المبرد مسبقاً في PBS، لمدة 10-15 دقيقة على الثلج، تليها ثلاث غسلات بـ PBS طازج. بعد ذلك، يتم نفاذ العينات كما هو موضح، ثم تُحضن مع anti-digoxigenin-FITC و 0.1% BSA المبرد مسبقاً في PBS، لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. وفي نهاية فترة التحضين، تُغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS طازج، وتُثبّت العينات باستخدام 4% paraformaldehyde المبرد مسبقاً في PBS، لمدة 10-15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.
بعد ثلاث غسلات بـ PBS، قم بصبغ النوى باستخدام 0.4 µg/mL من DAPI و 0.5% Triton-X المبرد مسبقاً في PBS لمدة 15 دقيقة على الثلج، تليها ثلاث غسلات نهائية بـ PBS. قم بتثبيت الشرائح باستخدام حبيبات فلورية، حسبما تقتضيه التجربة، وفي وسط تثبيت مناسب. بعد إزالة وسط التثبيت الزائد باستخدام مسحات معقمة، قم بإغلاق غطاء الشرائح لكل شريحة بعدة طبقات من طلاء الأظافر الشفاف، واستخدم مجهراً فلورياً للتأكد من التنفيذ الناجح للتجربة.
يمكن بعد ذلك التقاط الصور باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) لجمع صور العينات في غضون فترة تتراوح من ساعة واحدة إلى أسبوع من عملية التثبيت، وبقوة تكبير تبلغ 630 مرة.