تحفيز التضاعف التحللي للبروفاج من أجل التحليل الترانسكريبتومي

ابدأ بمزرعة بكتيرية تحمل جينوم بروفاج مدمجاً يتم تثبيطه بواسطة بروتين كابت للفاج، مما يحافظ على طور تحول ليزوجيني كامن.

أضف المادة المحفزة وحضن المزيج مع الرج لتحفيز الإجهاد الخلوي.

يؤدي الإجهاد الخلوي إلى تحفيز التشقق الذاتي لبروتين الكابت، مما يسمح للفاج المندمج بالانتقال من حالة الاندماج إلى التضاعف الحلحي.

ينفصل DNA العاثية الكامنة من الجينوم البكتيري، ومن ثم يقوم بنسخ الجينات التنظيمية المبكرة، وجينات تضاعف DNA المتوسطة، وجينات البنية والتحلل المتأخرة بالتتابع.

انقل المزرعة إلى حجم كبير من الوسط الغذائي لتخفيف المادة المحفزة، ثم قم بالتحضين للسماح باستعادة الخلايا لنشاطها.

أضف محلول الإيقاف في فترات زمنية محددة لوقف عملية النسخ والحفاظ على ملف الـ RNA في الخلايا البكتيرية.

قم بطرد المزرعة مركزياً وتخلص من الراشح. أعد تعليق الخلايا، وانقل المعلق إلى أنبوب صغير، ثم قم بالطرد المركزي.

أزل السائل الطافي وقم بالتجميد السريع للرواسب للحفاظ على سلامة الـ RNA.

أخيرًا، أضف كاشف استخلاص الـ RNA وقم بالتجانس لتمزيق الخلايا. وبذلك تصبح العينة جاهزة لعزل الـ RNA والتحليل النسخي اللاحق.

بعد ذلك، أضف norfloxacin بتركيز نهائي قدره 1 µg·mL⁻¹ إلى الدورق المسمى "المُحفَّز" الذي يحتوي على 80 mL من المزرعة. اخلط المزيج جيداً وحضنه عند 37 °C مع الرج بسرعة 180 rpm لمدة ساعة واحدة. اترك الخلايا لتتعافى عن طري