تنقية ناقلات الفيروس المرتبط بالغدة باستخدام كروماتوغرافيا الألفة

ابدأ باستخدام مستخلص خلوي مفلتر يحتوي على ناقلات الفيروس المرتبط بالغدّيات (AAV) وملوثات مشتقة من الخلية المضيفة.

مرر المستخلص عبر عمود تقارب يعتمد على الهيبارين.

ترتبط بروتينات القفيصة الفيروسية كهروستاتيكياً بمجموعات الهيبارين سالبة الشحنة.

اشطف العمود باستخدام محلول منظم لإزالة الملوثات غير المرتبطة.

قم بإضافة محلول منظم يحتوي على منظف لإذابة الحطام الغشائي.

اشطف مرة أخرى باستخدام المنظم الخالي من المنظفات.

أضف محلولاً منظماً مدعماً بالكاتيونات لإنشاء بيئة أيونية، ثم اغسل بمحلول منظم ذو ملوحة متوسطة لتحرير الشوائب ضعيفة الارتباط.

أضف محلولاً منظماً عالي الملوحة لفك الروابط بين الكبسيدة والهيبارين واستخلاص الجسيمات الفيروسية.

اجمع كسور الاستخلاص الغنية بالجسيمات الفيروسية السليمة وانقلها إلى أنابيب تركيز مركزية مزودة بأغشية ترشيح.

قم بطرد الأنابيب مركزياً لإزالة المحلول المنظم الزائد، ثم اجمع أجزاء الفيروس المركزة في أنبوبة.

اشطف الغشاء باستخدام المنظم لاستعادة الجسيمات الفيروسية المتبقية ورفع العائد إلى الحد الأقصى.

قم بإذابة lysate الخام عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل.

بمجرد إذابته، قم بترشيحه باستخدام مرشح 0.22 micron. وقبل البدء مباشرة في خطوات التنقية، قم بخملة جهاز التركيز بالطرد المركزي بإضافة أربعة milliliters من منظم المعالجة المسبقة للترشيح لكل عمود heparin-Sepharose مستخدم. ضع الأنابيب في مضخة 연دية.

قم بتشغيل المحاليل والأوساط بشكل متسلسل. استعد لعملية الكروماتوغرافيا عن طريق توصيل عمود heparin-Sepharose بسعة 5 mL بالأنابيب، وتمرير 25 mL من Bazell DMEM عبر العمود. بعد ذلك، قم بتحميل 0.2 µM من المستخلص الخام المصفى على العمود بمعدل تدفق يتراوح من قطرة إلى قطرتين في الثانية.

اغسل العمود بالتتابع لاستخلاص خمسة ملليلتر خمس مرات باستخدام HBSS يحتوي على 300 millimolar من كلوريد الصوديوم، مع المغنيسيوم والكالسيوم، وقم بتسمية الاستخلاصات الخمسة من E1 إلى E5. وعند الجاهزية، قم بتدوير المركز الطردي الذي يحتوي على محلول التخزين المسبق عند 900 ×g لمدة دقيقتين. تخلص من السائل المار. اغسل مرشح المركز الطردي بأربعة ملليلتر من HBSS مع المغنيسيوم والكالسيوم عن طريق التدوير عند 1000 ×g لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، أضف شطف الاستخلاص E2 إلى المركز الطردي، وقم بتدويره بسرعة 1000 ×g لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل المار. وبالمثل، قم بتدوير شطف الاستخلاص E3 في المركز الطردي حتى يصبح حجم الفيروس المركز حوالي 1 milliliter.

انقل الفيروس المركز من مركز الطرد المركزي باستخدام رأس ماصة P200 مزود بمرشح، واجمعه في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 milliliter. بعد جمع الفيروس، اشطف مركز الطرد المركزي بـ 200 microliters من HBSS المحتوي على المغنيسيوم والكالسيوم. قم بسحب السائل وإطلاقه بالماصة بقوة لمدة 30 ثانية لإزاحة أي فيروسات ملتصقة بالغشاء، ثم اجمع الفيروس المركز في نفس أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 milliliter.

امزج محتوى الأنبوب جيداً.