موسوعة JoVE للتجارب
علم الأحياء الدقيقة
0 مشاهدة • 3:07 دقيقة • August 31st, 2026
أحضر طبق حقن مجهري يحتوي على قطرة من وسط استنبات الأجنة في المنتصف، مغطاة بزيت معدني لمنع التبخر.
ضع الطبق تحت مجهر مقلوب.
ضع شعيرية الحقن المجهري وماصة التثبيت على نظام المانيبولاتور الدقيق (micromanipulator) تحت المجهر.
يتم تحميل شعيرية الحقن المجهري بمعلق من النواقل الفيروسية البطيئة التي تحمل الجين المنقول.
بعد ذلك، انقل أجنّة الجرذ المخصبة إلى الوسط.
قم بتثبيت الجنين باستخدام ماصة التثبيت عن طريق تطبيق الشفط.
باستخدام تكبير أعلى، أدخل شعيرة الحقن المجهري عبر الغلاف البروتيني السكري خارج الخلوي للجنين، وهي المنطقة الشفافة (zona pellucida)، ثم احقن معلق الفيروسات البطيئة في الحيز حول المحي.
بعد ذلك، انقل الأجنة المحقونة إلى طبق استنبات وقم بتحضينها.
يدخل الفيروس إلى الجنين ويطلق جينومه الذي يحتوي على الجين المنقول في السيتوبلازم.
لاحقاً، يتم نسخه عكسياً إلى DNA ويندمج في جينوم الجنين، مما يؤدي إلى دمج الجين المنقول.
الأجنة المحولة الآن جاهزة للمعالجة.
لإجراء الحقن المجهري للمتجهات الفيروسية البطيئة (lentiviral vector) تحت المنطقة الشفافة (zona pellucida) للأجنة في مرحلة الخلية الواحدة، استخدم جهاز سحب الماصات (pipette puller) لتحضير شعيرات زجاجية من بوروسيليكات مخصصة للحقن المجهري باستخدام فتيلة. بعد كل مرة يتم فيها تغيير الفتيلة أو استخدام شعيرة زجاجية جديدة، قم بإجراء اختبار المنحدر (Ramp test) لضبط المعلمات المثالية.
بعد ذلك، استخدم رأس شاحن دقيق لتحميل حوالي 2 µL من محلول الفيروس اللينتيوي المذاب حديثاً في كل ماصة حقن دقيق تحت غطاء تدفق صفائحي للسلامة البيولوجية. أضف قطرة بحجم 10 µL من وسط M2 إلى مركز غطاء طبق بتري بقطر 60 mm. غطِّ الوسط بالزيت المعدني وثبّت ماصة التثبيت والشعيرة الزجاجية للحقن الدقيق المحملة بالفيروس على جهاز تلاعب دقيق.
ضع طبق الحقن المجهري تحت مجهر مقلوب وانقل من 15 إلى 20 جنيناً في مرحلة الخلية الواحدة إلى قطرة وسط M2 في طبق الحقن المجهري. التقط جنيناً واحداً باستخدام ماصة التثبيت، واستخدم تكبيراً بمقدار 40 مرة والأنبوبة الشعرية الزجاجية لحقن المحلول الفيروسي البطيء تحت المنطقة الشفافة في الحيز المحيط بالبويضة، مع تثبيت الأنبوبة الشعرية تحت المنطقة الشفافة للحظة بعد إيصال الفيروس. وعندما يتم حقن جميع الأجنة، استخدم ماصة دقيقة لإعادة الخلايا المحقونة إلى طبق الزرع وأعد الطبق إلى حاضنة زراعة الخلايا حتى يحين موعد زرعها.