تنقية الإنزيم الدمجي الفيروسي باستخدام كروماتوغرافيا الألفة

ابدأ باستخدام معلق من الخلايا البكتيرية التي تعبر عن إنزيم الفيروس إنتيغريز (viral integrase) الموسوم بمتعدد الهيستيدين (polyhistidine-tagged).

قم بإجراء عملية السونكة للمعلق لتحطيم الأغشية البكتيرية وتحرير إنزيم الإنتيجريز.

انقل المادة المستخلصة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي فائق.

قم بالطرد المركزي بسرعة عالية لترسيب حطام الخلايا وجمع السائل الطافي.

بعد ذلك، يتم أخذ عمود كروماتوغرافيا معبأ براتنج مشحون بالنيكل ومعادلته بالمحلول المنظم.

حمّل المستخلص المصفى على العمود.

ترتبط البروتينات التي تحتوي على الهيستيدين بشكل ضعيف بالنيكل، بينما يرتبط الإنتيجريز الموسوم بمتعدد الهيستيدين بقوة.

اغسل العمود باستخدام المنظم لإزالة البروتينات غير المرتبطة، ثم أضف منظم الاستخلاص بتركيز متزايد خطياً من الإيميدازول.

يتنافس الإيميدازول مع الهيستيدين على الارتباط بالنيكل، مما يؤدي إلى تحرير الإنتيجريز.

اجمع الكسور وانقل أجزاء منها إلى أنابيب تحتوي على منظم التحميل.

سخن العينات لتمسخيخ البروتينات، ثم قم بتحميلها على هلام بولي أكريلاميد.

أجرِ عملية الترحيل الكهربائي وحلل حزم البروتين.

حدد الكسور التي تحتوي على إنزيم integrase نقي، دون وجود أي بروتينات ملوثة، وقم بتجميعها للحصول على إنزيم integrase الفيروسي المُنقى.

ابدأ بإذابة حبيبة واحدة من بكتيريا E.coli التي تعبر عن إنزيم integrase للفيروس الرغوي الأولي على الثلج. اس