تنقية الإنزيم الدمجي الفيروسي باستخدام كروماتوغرافيا الألفة

ابدأ باستخدام معلق من الخلايا البكتيرية التي تعبر عن إنزيم الفيروس إنتيغريز (viral integrase) الموسوم بمتعدد الهيستيدين (polyhistidine-tagged).

قم بإجراء عملية السونكة للمعلق لتحطيم الأغشية البكتيرية وتحرير إنزيم الإنتيجريز.

انقل المادة المستخلصة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي فائق.

قم بالطرد المركزي بسرعة عالية لترسيب حطام الخلايا وجمع السائل الطافي.

بعد ذلك، يتم أخذ عمود كروماتوغرافيا معبأ براتنج مشحون بالنيكل ومعادلته بالمحلول المنظم.

حمّل المستخلص المصفى على العمود.

ترتبط البروتينات التي تحتوي على الهيستيدين بشكل ضعيف بالنيكل، بينما يرتبط الإنتيجريز الموسوم بمتعدد الهيستيدين بقوة.

اغسل العمود باستخدام المنظم لإزالة البروتينات غير المرتبطة، ثم أضف منظم الاستخلاص بتركيز متزايد خطياً من الإيميدازول.

يتنافس الإيميدازول مع الهيستيدين على الارتباط بالنيكل، مما يؤدي إلى تحرير الإنتيجريز.

اجمع الكسور وانقل أجزاء منها إلى أنابيب تحتوي على منظم التحميل.

سخن العينات لتمسخيخ البروتينات، ثم قم بتحميلها على هلام بولي أكريلاميد.

أجرِ عملية الترحيل الكهربائي وحلل حزم البروتين.

حدد الكسور التي تحتوي على إنزيم integrase نقي، دون وجود أي بروتينات ملوثة، وقم بتجميعها للحصول على إنزيم integrase الفيروسي المُنقى.

ابدأ بإذابة حبيبة واحدة من بكتيريا E.coli التي تعبر عن إنزيم integrase للفيروس الرغوي الأولي على الثلج. استخدم جهاز سونيكيتور مزوداً بقرن حيوي (biohorn) بقطر 0.5 بوصة مع طرف دقيق مستدق بقطر 0.125 بوصة لإجراء السونكة لمدة 30 ثانية وبسعة 30% مع وضع الأنبوب على الثلج. بعد السونكة، انقل عينة الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي فائق مبرد، ثم قم بالتدوير بسرعة 120,000 ×g لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

بعد عملية الطرد المركزي، يجب أن تظهر ركيزة واضحة، وقد يكون السائل الطافي ذا لون أصفر. انقل السائل الطافي إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL مبرد. بعد ذلك، جهّز عمود FPLC بطول 110 mm وقطر 5 mm يحتوي على 1.5 mL من الراتنج المشحون بالنيكل.

أولاً، قم بتوصيل العمود بجهاز FPLC، ثم أضف المنظم. يجب أن يقوم الجهاز بجمع بيانات فورية عن الموصلية والامتصاصية فوق البنفسجية عند 280 nanometers. وينبغي أن تستقر قراءات الموصلية والامتصاصية فوق البنفسجية.

إذا لزم الأمر، استمر في تمرير المحاليل المنظمة عبر العمود حتى تستقر القراءات. وباستخدام حلقة فائقة (superloop)، قم بتحميل عينة البروتين على العمود بمعدل تدفق قدره 0.15 milliliters per minute وبحد أقصى للضغط يبلغ 0.5 megapascal. قم بتوصيل الحلقة الفائقة بجهاز AKTA FPLC.

بعد غسل العمود واستخلاص البروتينات، يتم أخذ أجزاء بحجم 15 µL من التدفق الأولي، والغسيل، والأجزاء ذات ذروة الامتصاص عند 280 نانومتر، وإضافة 15 µL من منظم عينات 2X SDS-PAGE إلى كل عينة. تُغلى العينات لمدة ثلاث دقائق. ثم يتم تحميل 10 µL من كل عينة على هلام 10% SDS-PAGE، جنباً إلى جنب مع 4 µL من معايير البروتين المصبوغة مسبقاً.

افحص الهلام بصرياً لتحديد الأجزاء التي يبدو أنها تحتوي على إنزيم integrase للفيروس الرغوي النموذجي بنقاوة عالية تقريباً. اجمَع هذه الأجزاء، وسجّل الحجم أثناء عملية السحب بالماصة، والذي يتراوح عادةً بين 8 و10 مللي لتر.