فرز جزيئات الفيروسات الفردية القائم على الفلورة للتحليل الجينومي

خذ معلقاً يحتوي على خليط متنوع من الفيروسات، إلى جانب ملوثات مثل الجسيمات الفيروسية المعيبة التي تفتقر إلى الأحماض النووية.

يتم صبغ هذه الفيروسات مسبقاً بصبغة فلورية ترتبط بالأحماض النووية للتمييز بين الفيروسات ذات الجينومات والملوثات.

مرر المعلق عبر جهاز فرز الخلايا المنشط بالفلورة، حيث يتم تحليل كل جسيم من حيث تشتت الضوء وكثافة الفلورة.

تعكس إشارة تشتت الضوء حجم الجسيمات، بينما تشير شدة الفلورة إلى محتوى الحمض النووي.

استبعد الملوثات التي لا تظهر أي تألق، والتكتلات التي تظهر تألقاً مرتفعاً بشكل غير طبيعي.

اختر جزيئات فيروسية فردية تحتوي على جينوم، وقم بفرزها مباشرة على شريحة ذات غرف مغطاة بالأغاروز من أجل التثبيت.

قم بتغطية كل بئر بطبقة إضافية من الأجاروز لتثبيت الفيروسات.

أصبحت هذه العينات الآن جاهزة لتضخيم وتحليل جينوم الفيروسات الفردية.

لفرز الفيروسات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي المجهز بأنابيب تضاعف ضوئي للتشتت الأمامي مخصصة أو FSC-PMT، ابدأ بتخفيف الجسيمات الفيروسية في محلول Tris-EDTA مرشح بمرشح 0.1 ميكرون. وبالنسبة لمجموعة مختلطة تحتوي على جسيمات العاثية T4 واللامدا، يتم ضبط FSC-PMT على 1000 وSSC على 200 لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى أقصى حد.

بعد تشغيل عينات الضبط، قم بتشغيل حوالي 100 microliters من المعلق الفيروسي المصبوغ حتى إجمالي 5,000 حدث. ثم استخدم مخططات SYBR Green