تحليل تثبيط النسخ في الخلية المضيفة الناجم عن الفيروس باستخدام قياس التدفق الخلوي

قم بتجهيز مستنبتات من الخلايا الثديية. قم بإصابة مستنبت الاختبار بفيروس، مع ترك مستنبت التحكم دون إصابة.

اترك الفيروس ليمتز بأسطح الخلايا، ثم استبدل الوسط الزراعي.

يدخل الفيروس إلى الخلية ويطلق جينومه. يعبر الفيروس عن بروتين ضراوة يعمل على زعزعة استقرار معقدات عوامل النسخ في الخلية المضيفة ويثبط عملية النسخ في المضيف.

ومع ذلك، تحافظ الخلايا الضابطة على نشاط عملية النسخ.

أضف نظيراً للنكليوزيد يتم دمجه في جزيئات الـ RNA حديثة التكوين.

قم بحصد الخلايا المغسولة.

قم بتثبيت الخلايا للحفاظ على بنيتها. قم بطرد الخلايا مركزياً واغسلها باستخدام محلول منظم.

أضف مادة منظفة لنفاذ الخلايا، ثم اغسلها.

أضف صبغة فلورية معدلة كيميائياً تتفاعل مع نظير النيوكليوسيد لوسم جزيئات الـ RNAs الناشئة؛ ثم قم بالغسل.

قم بإجراء الصبغ المناعي لوسم المستضدات الفيروسية فلورياً، وذلك لتمييز الخلايا المصابة.

استخدم قياس التدفق الخلوي للكشف عن الفلورة الخاصة بـ RNA المضيف والمستضد الفيروسي.

قارن شدة فلورة الـ RNA بين مجموعتي الضبط والاختبار. يشير الانزياح نحو الأسفل في مجموعة الاختبار، والذي يدل على انخفاض فلورة الـ RNA، إلى حدوث تثبيط للنسخ ناتج عن الإصابة بالفيروس.

وفقاً للتصميم التجريبي، يتم إصابة خلايا 293 بفيروس MP-12 بتعددية عدوى (MOI) تبلغ 3. يتم إزالة وسط النمو وإضافة مخزون الفيروس المخفف والتحضين لمدة ساعة واحدة في حضان