إنتاج فيروس المخلوي الرئوي المأشوب والموسوم ببروتين GFP باستخدام نظام تعبير T7

ابدأ بخليط من البلازميدات يحتوي على بلازميدات مساعدة تشفر بروتينات تضاعف ونسخ RSV وبلازميد منفصل يحمل cDNA لمضاد جينوم RSV كامل الطول يعبر عن GFP.

يتم وضع كل بلازميد تحت تحكم محفز T7.

أضف كاشف ترنسفكشن يعتمد على الليبوزوم وحضّنه للسماح بتكوين المعقدات.

أدخل هذه المعقدات في خلايا كلية الهامستر المعدلة وراثياً والتي تعبر عن T7 RNA polymerase ثم قم بالتحضين.

تدخل معقدات البلازميد إلى الخلايا، حيث يقوم إنزيم T7 RNA polymerase بنسخ بلازميدات RSV.

ينتج عن ذلك mRNAs فيروسية تشفر بروتينات التضاعف والنسخ، كما تولد RNA جينومي مضاد (antigenomic RNA) للفيروس المخلوي التنفسي (RSV)اتجه إيجابي.

باستخدام آليات الخلية المضيفة، تُنتج هذه الـ mRNAs بروتينات التضاعف والنسخ الفيروسي التي تُشكل معقد polymerase وظيفي للفيروس المخلوي التنفسي RSV.

يقوم معقد بوليميراز RSV بعد ذلك بتحويل الـ RNA موجب الاتجاه إلى RNA جينومي فيروسي.

يوجه هذا الـ RNA الجينومي عملية تخليق الـ mRNAs الفيروسية، التي تشفر البروتينات البنيوية وGFP.

يؤكد التألق الأخضر تحت المجهر الفلوري التعبير عن الجين الفيروسي وبدء إنتاج RSV المؤتلف.

في اليوم الذي يسبق عملية عفن التحويل (transfection)، يتم تعليق خلايا BSR-T7/5 في وسط كامل بتركيز 0.5 مليون خلية لكل ملليلتر. يتم توزيع 2 ملليلتر من معلق الخلايا في كل بئر من أطباق سداسية الآبار. تُحضن الأطباق عن