تقييم القدرة على التكرار الفيروسي باستخدام مقايسة النسخ العكسي الموشومة إشعاعياً

خذ السوائل الطافية للمستنبتات التي تحتوي على الفيريونات الوليدة المتحررة من الخلايا المضيفة المصابة إما بمتغير HIV-1 اختباري أو بمجموعة ضابطة من النوع البري.

يحمل الفيروس المختبر متغير جيني يغير من كفاءة التضاعف ويؤثر على إنتاج الفيريونات الوليدة.

أضف السوائل الطافية إلى خليط النسخ العكسي الذي يحتوي على نوكليوتيد مُوسوم إشعاعياً، ونوكليوتيد غير مُوسوم، وقالب RNA، وبادئ، وعوامل مساعدة، ومنظف، ومثبتات.

يتم التحضين للسماح بتكوين معقد القالب-البادئ بينما يعمل المنظف على تحلل الفيريونات، مما يؤدي إلى تحرير إنزيم النسخ العكسي (RT).

يقوم إنزيم RT بتخليق DNA من معقد القالب-البادئ، مع دمج النيوكليوتيد المسمى إشعاعياً.

انقل العينات إلى غشاء رابط للأحماض النووية وجففها في الهواء لتثبيت الحمض النووي المسمى إشعاعياً.

اغسل بشكل متكرر باستخدام المنظم والإيثانول مع الرج لإزالة المكونات غير المرتبطة.

اترك الغشاء ليجف في الهواء ثم لفه. وعرّضه لشاشة حساسة للإشعاع واكشف عن الإشارات باستخدام جهاز التصوير الفسفوري (phosphorimager).

تشير الإشارة المنخفضة في العينة المختبرة إلى مستويات أقل من RT، مما يعكس انخفاضاً في إنتاج الفيريونات مقارنة بالعينة الضابطة.

في هذا الإجراء، أضف من واحد إلى اثنين ميكرولتر من [α-33P] dTTP بتركيز 10 mCi/ml وأربعة ميكرولتر من dithiothreitol بتركيز 1 M إلى كل جزء قدره 1 ml من RT master