تحضير العينات للتقدير الكمي الفيروسي المعتمد على اللوسيفيريز

ابدأ باستخدام لوحة متعددة الآبار تحتوي على خلايا طلائية مصابة بفيروس معدل وراثياً.

يحمل الفيروس ترانزجين يشفر لإنزيم اللوسيفيراز.

استخدم مستنبتات حديثة من الخلايا الظهارية في طبق متعدد الفجوات جدرانه بيضاء.

انقل السائل الطافي الذي يحتوي على تركيزات غير معروفة من الفيروس إلى الآبار ذات الجدران البيضاء.

في الوقت نفسه، أضف تركيزات معلومة من الفيروس كمعايير.

قم بطرد الطبق مركزياً لتعزيز التلامس الوثيق بين الجسيمات الفيروسية ومستقبلات سطح الخلية المضيفة، ثم قم بالتحضين.

يدخل الفيروس إلى الخلية المضيفة ويقوم بنقل جينومه المكون من RNA ذي الشريط السالب.

ثم يقوم إنزيم RNA polymerase الفيروسي بنسخ الجينوم إلى mRNA.

باستخدام الآلية الخلوية للمضيف، يتم ترجمة mRNA إلى بروتينات فيروسية، بما في ذلك luciferase.

تزداد كمية لوسيفيراز المتراكمة داخل الخلية المضيفة مع زيادة التركيز الفيروسي.

أصبحت العينات جاهزة لمزيد من التقدير لتركيزات الفيروسات باستخدام مقايسة اللوسيفيراز.

قم بإعداد منحنى قياسي لـ VSV-Delta-51 في وسط DMEM خالٍ من المصل بحيث يكون التركيز النهائي لوحدات تشكيل اللويحات (plaque forming units) لكل ملليلتر بعد النقل إلى خلايا Vero كما يلي. قم بتحضير 50 µl من كل تركيز لكل طبق من خلايا Vero، مع إضافة 10% إضافية. يمكن نقل المنحنى القياسي إلى طبق ذو 96 بئراً عميقة. بعد ذلك، افحص خلايا Vero المزروعة في ط