تحديد الخلايا المصابة بفيروس الفاكسينيا المؤتلف باستخدام الانتقاء الأيضي والفلوري

ابدأ باستخدام خلايا ظهارية مصابة بفيروس vaccinia ومنقولة جينياً باستخدام ناقل بلازميدي لإعادة التركيب.

يحمل الناقل جيناً مستهدفاً موسوماً بفلوروسنت أخضر وجيناً للاختيار الأيضي موسوماً بفلوروسنت أحمر تحت محفز فيروسي.

أثناء تضاعف الحمض النووي الفيروسي، يتم إدراج كاسيت البلازميد في الجينوم الفيروسي.

اجمع الخلايا في وسط خالٍ من المصل.

استخدم دورات التجميد والإذابة لتحلل الخلايا وتحرير الفيروسات.

حضّر تخفيفات متسلسلة للمحلل.

قم بإصابة خلايا ظهارية حديثة باستخدام المستخلص المخلل المخفف للحصول على لويحات منفصلة وفردية.

أضف وسطاً يحتوي على المصل لضمان بقاء الخلايا، وكاشف اختيار استقلابي، ثم قم بالتحضين.

يعمل كاشف الانتقاء على تثبيط الإنزيمات المشاركة في تخليق النيوكليوتيدات. وتعبّر الخلايا المصابة التي تحمل جين الانتقاء الأيضي فقط عن إنزيم بديل يسمح بتخليق النيوكليوتيدات، مما يمكنها من البقاء على قيد الحياة.

قم بإزالة الوسط وملاحظته تحت مجهر فلوري.

يشير وجود كل من الفلورة الحمراء والخضراء في اللويحة إلى نجاح دمج الكاسيت والتعبير عن الجين المستهدف.

قم بإصابة طبقة أحادية من خلايا BS-C-one بفيروس vaccinia في وسط خالٍ من المصل.

بعد ساعة واحدة من العدوى، قم بإنقاذ الخلايا باستخدام وسط Dulbecco's modified eagle. ثم قم بالترانسفكشن باستخدام خليط من بلازميد ناقل إعادة التركيب وكواشف الترانسفكشن بنسبة 3:1 في و