الترانسدكشن الفيروسي الغدي المدمج مع التثبيط الجيني بوساطة الـ siRNA في الخلايا السرطانية

خذ مزرعة من خلايا سرطان بشرية تعبر عن بروتين مستهدف داخلي وقم بإزالة الوسط الزرعي.

خذ معلقاً من الفيروس الغدي المؤتلف الذي يحمل جيناً يشفر البروتين المستهدف الملحق بفلوروفور.

أضف حجماً صغيراً من المعلق الفيروسي إلى الخلايا لضمان التلامس الوثيق بين الفيروس وسطح الخلية.

يُحضن مع الرج من حين لآخر للسماح بارتباط الفيروس.

أضف وسطاً غذائياً إضافياً إلى المزرعة.

بعد ذلك، أضف معقد siRNA-فوسفات الكالسيوم لاستهداف mRNA للبروتين المستهدف الداخلي ثم قم بالتحضين.

يعزز فوسفات الكالسيوم من امتصاص siRNA، ويتم تحميل siRNA في معقد RISC.

يرتبط معقد siRNA–RISC بعد ذلك بـ mRNA المستهدف ويقوم بشطره، مما يؤدي إلى تثبيط التعبير البروتيني.

وفي الوقت ذاته، يدخل الفيروس الغدي (adenovirus) إلى الخلية ويطلق حمضه النووي DNA، الذي يوجه التعبير عن البروتين المستهدف الملحق بفلوروفور (fluorophore).

يتيح ذلك استنفاد البروتين المستهدف الداخلي والاستبدال المتزامن ببروتين موسوم بفلوروفور.

اغسل الخلايا بالمحلول المنظم وأجرِ التصوير الفلوري لتحليل البروتين المستهدف.

ضع ملصقاً على أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter لكل حالة، وأضف 400 microliters من وسط alpha MEM minus الدافئ. بعد إذابة حصص الفيروسات ببطء على الثلج، أضف الحجم المطلوب من كل فيروس إلى الأنابيب واخلط برفق باستخدام الماصة. بعد ذلك، وبعد سحب الوسط من الخلايا، أضف مزي