جيم ايليجانس Butanone التعلم الإيجابي ، قصيرة الأجل وطويلة الأجل فحوصات الذاكرة الترابطية

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار الذاكرة قصيرة وطويلة المدى لارتباط إيجابي مُكتسب بين الغذاء وجاذب كيميائي وهو البيوتان، وذلك باستخدام *C. elegans* كنموذج. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجويع ديدان بالغة شابة متزامنة ومغذاة جيداً لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك، يتم تدريب الديدان في وجود الغذاء ومادة البوتان المعروفة من خلال التكييف المتلاحق لدراسة الذاكرة الترابطية قصيرة المدى، ومن خلال التكييف المتباعد لدراسة الذاكرة الترابطية طويلة المدى. وبعد التكييف، يتم قياس الانجذاب الكيميائي نحو البوتان المعروف ومقارنته بالانجذاب الكيميائي الأولي. ولدراسة الاحتفاظ بالذاكرة، يتم الحصول على نتائج توضح مدة الذاكرة الترابطية قصيرة وطويلة المدى لارتباط الغذاء بالبوتان المعروف بناءً على التغييرات في مؤشر التعلم.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات الشيخوخة الإدراكية والأمراض، مثل المسارات الجينية المطلوبة للوظيفة العصبونية في حالات الشيخوخة الطبيعية وحالات الأمراض التنكسية العصبية، وكيفية تحسين التعلم والذاكرة. في ظروف الضعف الإدراكي، يتم تحضير الديدان باستخدام الطرق القياسية على أطباق أوساط نمو بارتفاع 100 millimeter، مجهزة بـ one milliliter من OP 50 e coli. استخدم البالغين الصغار بكثافة تبلغ حوالي 5, 000 دودة أو أقل لكل طبق.

اجمع الديدان عن طريق سكب محلول M nine المنظم برفق فوق الطبق وتحريك الديدان لتحريرها. حاول تقليل عملية التقليب لتجنب إزاحة البكتيريا غير المرغوب فيها. بعد ذلك، أمل الطبق واسحب خليط المحلول المنظم والديدان من الزاوية.

باستخدام ماصة P 1000، انقل الديدان إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليليتر. احرص على عدم سحب الديدان مقابل جدار الطبق إذا كانت هناك ديدان متبقية في الطبق.

كرر هذه الخطوة من مرة إلى مرتين. اترك الديدان تترسب في قاع الأنبوب بفعل الجاذبية. لا يُنصح باستخدام الطرد المركزي للحصول على أفضل النتائج.

بمجرد استقرار العينة، قم بإزالة السائل الطافي باستخدام الشفط واغسلها بما لا يقل عن ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من محلول M9 المنظم. يجب العمل بسرعة لتجنب حالة التجويع. كرر هذه العملية مرتين ليصبح إجمالي عدد مرات الغسل ثلاث مرات.

في هذه المرحلة، يمكن عزل مجموعة من الديدان لتكون بمثابة المجموعة الساذجة (naive group) في اختبارات الانجذاب الكيميائي التي سيتم عرضها لاحقاً لتهيئة الديدان للتدريب؛ أضف من 3 إلى 4 مل من محلول M9 المنظم إلى الأنبوب واترك الديدان في حالة تجويع في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قم بتحضير أطباق التهيئة عن طريق تخطيط 2 µL من البيوتان بتركيز 10% في الإيثانول بتركيز 95% على الجانب الداخلي لأغطية أطباق NGM مقاس 60 ملم والتي تم استزراعها بـ 500 µL من بكتيريا *E. coli* سلالة OP50. قم بإزالة السدادة من أنبوب الديدان الجائعة واستخدم ماصة P1000 لنقل 100 إلى 200 µL من الديدان إلى كل طبق من أطباق التهيئة. تُحضن أطباق التهيئة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة بعد عملية التهيئة.

اغسل الديدان من الأطباق باستخدام حوالي 1 ml من محلول M9 المنظم وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ml. كرر طرق الغسل اللطيفة الموضحة سابقاً حتى يصبح المحلول المنظم صافياً. بعد الغسل، يمكن إزالة مجموعة فرعية من الديدان واختبارها في مقايسة الانجذاب الكيميائي لتعمل كمجموعة الزمن صفر لتعلم الارتباط بـ 1x mast، وذلك لإعداد الأطباق التي تمثل نقاطاً زمنية إضافية.

انقل من 100 إلى 200 ميكروليتر من الديدان إلى أطباق NGM بقطر 60 مليمتر مُلقحة مسبقاً. قم بحضن هذه الأطباق بعد تعريضها للظروف لمدة 0.5 أو ساعة واحدة أو ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد كل نقطة زمنية، اغسل الديدان بلطف من الأطباق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليمتر، وكرر ذلك من مرة إلى مرتين إضافيتين.

باستخدام محلول M nine المنظم مع اتباع نفس إجراءات الغسل اللطيفة، يتم اختبار الذاكرة الترابطية قصيرة المدى باستخدام مقايسة الانجذاب الكيميائي، والتي سيتم توضيحها لاحقاً. قم بتجهيز أطباق التهيئة والديدان كما تم توضيحه في التدريب قصير المدى، ولكن اسمح للديدان بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة فقط. بعد التحضين، اجمع الديدان كما تم توضيحه سابقاً.

انقلها إلى أطباق NGM غير الملقحة بقطر 60 مليمتر. قم بتجويع الديدان في الأطباق غير الملقحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد تجويع الديدان، اغسلها باستخدام محلول M9 المنظم وأعدها إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مليمتر. كرر هذه الخطوات حتى يتم إكمال سبع دورات تهيئة وست دورات تجويع إجمالاً.

عند اكتمال عملية التكييف، يتم غسل الديدان من أطباق التكييف وإعادتها إلى أنبوب مخروطي. وكما تم توضيحه سابقاً، يمكن استخدام مجموعة من الديدان لاختبار التعلم الترابطي المتباعد زمنياً لسبع مرات مباشرة بعد التكييف. انقل بقية مجموعة الديدان إلى أطباق HGM بقطر 100 مليمتر تحتوي على 1 مليلتر من OP 50.

مرة أخرى، ضع من 100 إلى 200 ميكرولتر من الديدان في كل طبق لضمان وجود كمية كافية من البكتيريا لدعم هذه الجمهرة. قم بتحضين أطباق ما بعد التكييف عند درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة 16 أو 24 أو 40 ساعة، وهي تمثل النقاط الزمنية للذاكرة الترابطية طويلة المدى لاختبار الذاكرة الترابطية طويلة المدى للارتباط المعروف بين الطعام والبيوتان. اغسل الديدان برفق من الأطباق وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مللي لتر، وكرر الغسل من مرة إلى مرتين باستخدام منظم M9 بعد كل نقطة زمنية، ثم اختبر الديدان في مقايسة chemo Texas.

لتحضير أطباق اختبار الانجذاب الكيميائي، ضع علامات على قاع أطباق NGM غير المستقرة بحجم 100 مليمتر في ثلاث نقاط بالقرب من الجوانب كما هو موضح هنا. ضع 1 µL من sodium azide بتركيز 1 M في نقاط المادة الجاذبة ونقاط التحكم. يتم القيام بذلك في غضون 15 دقيقة كحد أقصى قبل بدء الاختبار لتقليل انتشار عوامل الشلل.

في الموضع التالي، ضع ميكرولتر واحد من كل من الإيثانول 95% والبيوتون 10% في المواضع المناسبة على لوح المقايسة المحدد، فوق أزيد الصوديوم الذي تم وضعه مسبقاً. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من منظم M nine من أنبوب الديدان المترسبة.

استخدم ماصة P 20 ذات رأس مقطوع مسبقاً لنقل 15 µL من الديدان على ثلاث دفعات، كل دفعة بحجم 5 µL، إلى نقطة الأصل في لوحة المقايسة. بعد ذلك، قم بلف زاوية منديل Kim wipe لتشكيل نقطة صغيرة واستخدمها لامتصاص فائض منظم M9، مع الحرص على عدم ثقب الآجار.

يؤدي إزالة المحلول المنظم الزائد إلى تحرير الديدان على لوحة المقايسة. وفي حال استخدام التصوير لعد الديدان، فإن التقاط صورة لنقطة الأصل مباشرة بعد هذا التحرير سيعطي العدد الإجمالي للحيوانات في لوحة المقايسة. تُحضن لوحة مقايسة الانجذاب الكيميائي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بعد التحضين، ثم يتم عد عدد الديدان عند نقاط الأصل وبقع الإيثانول والبيوتانون، بالإضافة إلى العدد الإجمالي للديدان في لوحة المقايسة.

بشكل عام، ستكون الديدان التي شُلّت حركتها بواسطة sodium azide ضمن نصف قطر يبلغ سنتيمتراً واحداً من البقع وستبدو مستقيمة تماماً. ومع تكدس العديد من الحيوانات فوق بعضها البعض، يمكن عد الديدان يدوياً أو تقديرها كمياً باستخدام برمجيات التصوير والتحليل. ونحن نفضل الخيار الأخير لسهولته وموثوقية نتائجه.

بمجرد تحديد كمية الديدان عند بقع الإيثانول والبيوتون الأصلية، احسب مؤشر KeyAx كما هو موضح هنا. يبلغ مؤشر الانجذاب الكيميائي الخام النموذجي للديدان من النوع البري التي تستجيب لـ 10%Butone حوالي 0.2. وعادةً ما يؤدي التدريب الجماعي أو المتباعد إلى زيادة مؤشر الانجذاب الكيميائي (CHEMOTAXIS) إلى 0.7 إلى 0.8 عند الزمن صفر، مما يعطي مؤشر تعلم يبلغ حوالي 0.6.

تتأثر عملية الانجذاب الكيميائي الفطرية بشكل كبير بمدى الرعاية السليمة للديدان. يوضح هذا الشكل الفرق الملحوظ في مؤشر الانجذاب الكيميائي (CI) بين الديدان الفطرية التي تتغذى جيداً وتلك الجائعة، ويسلط الضوء على أهمية التقنية الصحيحة. ينعكس الاحتفاظ بالذاكرة في الوقت الذي يستغرقه مؤشر الانجذاب الكيميائي للعودة إلى مستويات الحالة الفطرية عندما يكون مؤشر التعلم مساوياً للصفر في الحيوانات من النوع البري.

تبدأ الذاكرة الترابطية قصيرة المدى في التراجع بعد ساعة واحدة من التدريب المكثف الذي يستمر لنحو ساعتين، وتكون مستقلة عن عامل النسخ Creb بالمقارنة. وعادةً لا تبدأ الذاكرة الترابطية طويلة المدى في التراجع بشكل ملحوظ إلا بعد 16 ساعة من التدريب الموزع الذي قد يستمر حتى 40 ساعة، وتكون هذه الذاكرة معتمدة على Creb. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن اختبارات الانتحاء الكيميائي يمكن أن تتأثر بالتجويع أو الروائح المفرطة في البيئة المحيطة، كما يمكن أن تتعطل الذاكرة والديدان بسبب التحريك الفيزيائي المفرط.