متعددة الماوس تشريحي عصبي التصوير بالرنين المغناطيسي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحقيق توصيف ظاهري عالي الإنتاجية سواء باستخدام فئران حية أو مثبتة، وذلك عن طريق إجراء تصوير بالرنين المغناطيسي لعدة أدمغة للفئران. يتم تحقيق ذلك أولاً بتخدير كل فأر. بعد ذلك، وبالنسبة للفحص في الجسم الحي، يوضع كل فأر على زلاجة ذات حجم مناسب قبل تركيبه في مصفوفة تحميل ووضعه داخل تجويف المغناطيس.

أو للتصوير خارج الجسم (ex vivo)، يتم إجراء تروية عبر القلب، وعزل بنية الجمجمة ووضعها في أنابيب تصوير، والتي توضع بعد ذلك في مصفوفة ملفات لولبية ذات 16 قناة متمركزة في تجويف المغناطيس. وفي النهاية، يمكن الحصول على أحجام تصوير بالرنين المغناطيسي ثلاثية الأبعاد تظهر صوراً دماغية عالية الجودة مناسبة للتنميط المظهري، وللبنى الرئيسية والثانوية في دماغ الفأر. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل علم الأنسجة في أنها تحافظ على التشريح العياني للعينات وهي لا تزال داخل جماجمها، وتسمح بتغطية الدماغ بالكامل وإجراء تحليل ثلاثي الأبعاد.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في المجالات الطبية الحيوية، مثل العلاقة بين الجينات والتمايزات التشريحية التي تمثل الأنماط الظاهرية في نموذج الفأر للمرض. وبوجه عام، سيجد الأشخاص المبتدئون في هذه التقنية أن تطوير مصفوفات تحميل الفئران المخصصة وملفات الترددات الراديوية المطلوبة لتصوير الدماغ عالي الإنتاجية هو الجزء الأكثر تحدياً. قبل البدء في هذا البروتوكول، يجب الحصول على موافقة لجميع إجراءات التعامل مع الحيوانات من لجنة رعاية الحيوان المحلية في مؤسستك، أو اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات، أو ما يعادلها من الإجراءات الأولى مثل التحديد والوزن.

يجب إجراء تسجيلات الحيوانات تحت خزانة السلامة البيولوجية. بعد ذلك، انقل الحيوانات إلى حاوية بلاستيكية قابلة للتعقيم بجهاز الأوتوكلاف لنقلها إلى غرفة تحريض الرنين المغناطيسي (MRI). قم بتخدير الحيوانات المقرر فحصها في غرفة التحريض مسبقة التسخين باستخدام 4% ISO fluorine وأربعة لترات في الدقيقة من الأكسجين.

تعتبر الحيوانات مخدّرة بالكامل بمجرد توقفها عن الاستجابة لقرص القدم. يمكن إزالة الفراء من منطقة الصدر باستخدام مزيل شعر مثل nare إذا لزم الأمر، لضمان تلامس أفضل مع جهاز تخطيط كهربائية القلب (ECG) وأجهزة مراقبة درجة الحرارة المدمجة في المزلقة المخصصة. قم أيضاً بتطبيق بدائل الدموع (ISV) مثل tears natural PMM على العينين لمنع الجفاف، واحقن حوالي 0.3 milliliters من المحلول الملحى عن طريق الحقن تحت الجلد.

لترطيب الحيوانات. الآن، يتم وضع الفئران على زلاجات فردية تحتوي على مجسات مدمجة لتخطيط كهربائية القلب والتنفس ودرجة الحرارة. يجب الحرص على وضع الأطراف الأمامية والخلفية في التجاويف الموجودة في الزلاجات.

في الحالات التي تتطلب مراقبة تخطيط كهربائية القلب (ECG)، تأكد منما يتماشى المناطق الخالية من الشعر في الجانب السفلي للفأر مع مجسات تخطيط كهربائية القلب، وقم بتثبيت كل حيوان باستخدام حزام للرأس وحزام للأنف، ثم قم بتمرير كل زلاجة داخل أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter مفتوح الطرف. يمكن تحضير ما يصل إلى سبعة فئران حية للمسح في جلسة تصوير واحدة. بعد ذلك، قم بتركيب الأنابيب المخروطية على مصفوفة التحميل.

تأكد من توصيل جميع خطوط المراقبة الفسيولوجية بمجرد تحميل جميع الحيوانات. اضبط مستوى isof fluorine في تجويف المغناطيس على 2% ومستوى الأكسجين على ثمانية لترات في الدقيقة. الآن قم بنقل مصفوفة التحميل إلى المغناطيس وضعها على نظام السكة.

استخدم نظام السكك لربط مصفوفة التحميل بخلية الفئران، والتي صُممت لتموضع الفئران بشكل موحد داخل كل ملف تردد راديوي يقع في مركز تجويف المغناطيس. عند الإدخال الكامل في المغناطيس، تستقر أنابيب الطرد المركزي في نظام إيصال التخدير داخل ملفات RF كما هو موضح هنا، حيث يتم توفير ISOF fluorine ممزوجاً بالأكسجين من خلية الفئران وإلى العينة عبر أنبوب يمتد على طول محور كل ملف منفرد. يتدفق خليط غاز التخدير هذا إلى الأنابيب متجاوزاً الفئران، ثم يتم تجميعه بواسطة وحدة تخلص نشطة متصلة بخلفية مصفوفة التحميل.

بناءً على القراءات الفسيولوجية للحيوانات، مثل التنفس ودرجة الحرارة، يجب ضبط مستويات isoflurane بين 0.9 و2%. الآن، قم بفحص الحيوانات باستخدام تسلسل fast bin echo. تستغرق مدة كل مسح ثلاثي الأبعاد ثلاث ساعات تقريباً، بدقة صورة تبلغ 125 ميكرومتر. تأكد من مراقبة قراءات ECG والتنفس ودرجة الحرارة لكل حيوان طوال فترة المسح.

يجب أيضاً الحفاظ على دفء الحيوانات أثناء جلسة المسح عن طريق تدفق هواء دافئ. وعند اكتمال المسح، قم بإزالة مصفوفة التحميل من المغناطيس ووضعها في غرفة تحريض دافئة مملوءة بـ 100% oxygen. ثم قم بإخراج الحيوانات من الأنابيب ونقلها إلى حاويات بلاستيكية محكمة الإغلاق لنقلها إلى كابينة السلامة البيولوجية.

وأخيراً، ضع الحيوانات في قفص دافئ وخالٍ من التيارات الهوائية واتركها حتى تفيق من التخدير لإجراء التصوير الحيواني خارج الجسم (exvivo). أولاً، قم بتخدير الحيوانات تخديراً كاملاً باستخدام حقنة داخل الصفاق من مزيج من الكيتامين والزيلازين. وقبل البدء في عملية التروية، تحقق من مستوى التخدير الجراحي عن طريق قرص إصبع القدم أو الكف.

افتح التجويف الصدري وأدخل إبرة أو مجموعة حقن مجنحة آمنة في البطين الأيسر للقلب. بعد ذلك، اقطع الأذين الأيمن لبدء التروية عبر القلب. أولاً، قم بالغسل باستخدام 30 milliliters من محلول ملحي منظم بالفوسفات بتركيز 1x في درجة حرارة الغرفة، ممزوجاً مع 1 µL/mL من الهيبارين و 2 mM من البروتياز، وبمعدل تدفق يبلغ 100 milliliters في الساعة تقريباً.

يستغرق هذا الإجراء حوالي 20 دقيقة. تلي ذلك خطوة تثبيت أخرى باستخدام 30 milliliters من بارافورمالدهيد بتركيز 4% في درجة حرارة الغرفة، ممزوجاً بـ two millimolar من pro hands وبمعدل تدفق 100 milliliters في الساعة. الآن، يتم فصل رأس الحيوان وإزالة الجلد، والفك السفلي، والأذنين، وطرف الأنف الغضروفي.

بعد ذلك، ضع هيكل الجمجمة المتبقي في 4% paraformaldehyde ممزوجاً بـ 2 mM ProHance واتركه طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، انقل العينة إلى محلول 1x phosphate buffered saline ممزوج بـ 0.02% sodium azide و 2 mM ProHance لغرض الحفظ. يجب إجراء مسح MRI ثلاثي الأبعاد عالي الدقة بقوة 7 Tesla بعد مرور أربعة أيام على الأقل، على ألا تتجاوز المدة شهرين ونصف.

بعد عملية التروية، ضع الأدمغة المراد تصويرها في مصفوفة ملف لولبي ذات 16 قناة، ثم ضعها في جهاز الماسح. الآن، قم بمسح العينات باستخدام تتابع صدى المغزل السريع.

تبلغ مدة هذا المسح حوالي 12 ساعة، وستكون للصور النهائية دقة متساوية المناحي (isotropic) تبلغ 32 ميكرومتر. بعد اكتمال المسح، أخرج العينات من ملف التصوير وضع كل جمجمة في محلول فورمالين بنسبة 10% مع 2 millimolar pro hands للحفاظ على المظهر التمثيلي في الجسم الحي. تظهر هنا صور متعددة لدماغ الفأر تم الحصول عليها من مسح واحد استغرق ثلاث ساعات.

يوضح هذا الشكل ثلاثة محاور عرض لكل فأر من الفئران السبعة التي تم فحصها. تظهر هنا صورة تمثيلية للدماغ خارج الجسم (ex vivo) بدقة متساوية تبلغ 32 micron. وهنا يمكننا رؤية عرض ثلاثي الأبعاد لحجم صورة خارج الجسم (ex vivo) بعد معالجتها.

يمكن إجراء هذه التقنية في الجسم الحي خلال ثلاث إلى أربع ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. ويمكن للباحثين في العديد من المجالات الطبية الحيوية استخدام هذه التقنية لاستكشاف أمراض مثل الذئبة الحمراء، ومرض هانتنغتون، ومرض ألزهايمر في نموذج الفأر. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير معظم العينات، سواء كانت حية أو مثبتة، للحصول على صور دماغية عالية الجودة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي MRI.

شكرًا للمشاهدة.