عزلة ريبوسوم ترجمة المتضمن ببتيديل - tRNAs للتحليلات الوظيفية والهيكلية

يتمثل الهدف العام للتجربة التالية في تحليل بنية ووظيفة الريبوسومات النقية التي تحتوي على tRNA ببتيدي فريد. ويتحقق ذلك من خلال إجراء اختبارات ترجمة في المختبر باستخدام مستخلصات خالية من الخلايا ومستنزفة من عامل التحرير، وmRNA مُوسوم بالبيوتين، وذلك لتوليد معقدات ريبوسوم-pep tRNA متوقفة مرتبطة بجزيئات mRNA المُوسومة بالبيوتين. وكخطوة ثانية، تُخلط حبيبات بارامغناطيسية مرتبطة بالستريبتوافيدين مع اختبارات الترجمة في المختبر للسماح بتفاعلها مع جزيئات البيوتين الموجودة في mRNA.

لاحقاً، يتم استخلاص الخرزات باستخدام مجالات مغناطيسية قامت بسحب معقدات الريبوسوم والببتيد tRNA المتوقفة والمرتبطة بـ mRNAs من إجمالي التفاعل. بعد ذلك، يمكن خلط معقدات الريبوسوم والببتيد tRNA المنقاة مع عوامل الترجمة مثل عامل تحرير الترجمة، أو المضادات الحيوية المثبطة، أو عوامل التعديل الكيميائي من أجل تحليل الوظيفة. يتم الحصول على نتائج تتعلق بتثبيط وبنية الريبوسوم تُظهر تثبيط تحلل الببتيد tRNAs وارتباط ذلك بتغيرات هيكلية في الريبوسومات بناءً على نشاط ببتيد ترانسفيراز أو مقايسات إنهاء الترجمة باستخدام هلام SDS أو Tris Racine page gels، ومقايسات حماية التعديل باستخدام هلام urea page gels.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الطرد المركزي التفاضلي، في أن العينات المعزولة تحتوي غالباً على ريبوسومات ذات مجموعة واحدة فقط من pep tRNA. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الجوهرية في مجال التعبير الجيني، مثل طبيعة متعدد الببتيد الناشئ، وكيفية تأثير المضادات الحيوية على وظيفة الريبوسوم مثل تعديل عملية الترجمة. لبدء هذا الإجراء، يتم الحصول على جرامين من قرص بكتيري جاف من e coli مستخلص من مزارع في طور النمو اللوغاريتمي.

اغسل الراسب عن طريق إعادة التعليق في لتر واحد من المنظم، يليه الطرد المركزي عند 5,000 Gs لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد إجراء غسلتين، أعد تعليق الراسب البكتيري الناتج في 40 milliliters من المنظم وقم بتفتيت الخلايا البكتيرية باستخدام المكبس الفرنسي (French press) بتطبيق ضغط قدره 6,000 PSI. يتوافق هذا الضغط مع 600 وحدة باستخدام مكبس بمقاس بوصة واحدة.

اجمع المعلق الممزق في أنبوب زجاجي نظيف سعة 50 milliliter. عالج المعلق الممزق بـ 1 millimolar من DIO triol أو DTT، ثم قم بطرد العينة مركزياً عند 30,000 Gs لمدة 30 دقيقة. تخلص من السائل الطافي الناتج وكرر عملية الطرد المركزي.

احفظ السائل الطافي الذي تم الحصول عليه من عملية الطرد المركزي الثانية، ثم وزع السائل الطافي النهائي في أنابيب دقيقة. وأخيراً، قم بالتجميد السريع للعليقات باستخدام خليط من الثلج الجاف والإيثانول أو النيتروجين السائل، واحفظ العينات عند درجة حرارة -60 أو -80 درجة مئوية.

ابدأ بتحضير مستخلصات خالية من الخلايا ومستنفدة من عامل RF two عن طريق خلط 4.5 milliliters من حبيبات protein A spheros four B مع خمسة milliliters من مضاد مصل anti RF two. قم بتدوير الخليط على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم قم بطرد الخليط مركزياً عند 2, 500 Gs لفصل الحبيبات عن مضاد المصل.

تخلص من الطافي. تحتوي الحبيبات الآن على أجسام anti RF two المضادة، وسيُشار إليها باسم حبيبات anti RF two. اغسل الحبيبات عن طريق إعادة تعليقها في 1 mL من buffer bee.

ثم قم بطرد الخرزات مركزياً كما سبق لفصل خرزات anti RF two عن المنظم B. كرر عملية الغسيل هذه مرتين. بعد غسل الخرزات، اخلط 1 mL من المستخلص الخالي من الخلايا مع 150 µL من خرزات anti RF two، ثم حضن الخليط على عجلة دوارة عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعتين بعد التحضين. قم بطرد الخليط مركزياً عند 10,000 ×g لفصل المستخلص الخالي من الخلايا عن الخرزات.

قم بإزالة الطافي ومعالجته مرة أخرى باستخدام 150 microliters إضافية من حبيبات anti RF two قبل تكرار عملية الحضن والترسيب مرة أخرى. قم بتوزيع محلول المستخلص الخالي من الخلايا والمنضب من RF two النهائي في أنابيب دقيقة بمعدل 100 microliters لكل أنبوب. قم بتجميد الحصص باستخدام خليط من الثلج الجاف والإيثانول أو النيتروجين السائل، وتُخزن في درجة حرارة minus 60 أو minus 80 degrees Celsius.

قم بتحضير تفاعل PCR عن طريق دمج قالب البلازميد الذي يحتوي على التسلسلات المراد ترجمتها، والنيوكليوتيدات deoxy nucleotides، و DTPs، و DNA polymerase السليم، في محلول PCR buffer استراتيجي. وبمجرد تحضير عينة PCR، قم بإجراء تفاعل التضخيم، ثم قم بترسيب الـ DNA لتنقية نواتج PCR عن طريق إضافة عُشر حجم العينة من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 molar وبدرجة pH 5.2، وحجمين من الإيثانول المبرد بالثلج. وبعد تكرار إجراء الترسيب مرة أخرى، نقوم بتعليق الـ DNA الناتج في 100 µL من dathyl percarbonate أو ماء معالج بـ dsy.

تحقق من سلامة نواتج تفاعل PCR عن طريق الرحلان الكهربائي على هلامات الأجاروز. عادةً، ينتج عن هذا الإجراء 100 micrograms من ناتج DNA بطول 600 base pair. قم بتحضير تفاعل نسخ في المختبر (in vitro transcription) بحجم 100 microliter في ماء معالج منزوع البيروجين عن طريق خلط five micrograms من قطعة DNA الناتجة عن تفاعل PCR مع ribonucleotides و UTP المسمى بالبيوتين ومزيج إنزيم T seven.

يتم تحضين خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. ولتقدير كمية mRNA التي تم الحصول عليها، يتم التخلص من قالب DNA بإضافة RNA free DNase. ثم يُحضن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

لتنقية نواتج mRNA، يتم تريب الـ RNA مرتين عن طريق إضافة عُشر الحجم من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 molar وpH 5.2 وحجمين من الإيثانول البارد، ثم يُعاد تعليق mRNA المترسب في 100 microliters من الماء المعالج بـ dpci. يتم التحقق من سلامة نواتج mRNA الموسومة بالبيوتين عن طريق الفصل الكهربائي على هلامات aros. عادةً ما ينتج عن هذا الإجراء ما بين 1 إلى 2 milligrams من ناتج mRNA موسوم بالبيوتين بطول 600 nucleotide. لبدء عزل الريبوسومات المترجمة التي تحتوي على peptid TRNA، يتم تحضير 500 microliter من خليط تفاعل الترجمة في المختبر (in vitro) في ماء معالج بـ dey.

أولاً، قم بتحضير خليط التفاعل المنظم الموصوف في البروتوكول المكتوب المرفق، ثم أضف 75 M من كل حمض أميني باستثناء الحمض الذي سيتم استبداله بحمض أميني مشع. بعد ذلك، أضف من 20 إلى 50 µL من مستخلص الخلايا الخالي من RF two إلى المحلول المنظم الذي يحتوي على الأحماض الأمينية. قم بحضن الخليط لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح بتنشيط الريبوسومات.

بمجرد تنشيط الريبوسومات، أضف من 10 إلى 15 µg من الـ mRNAs المسمى بالبيوتين إلى العينة. ثم قم بحضن خليط التفاعل عند درجة حرارة 37 °C لمدة 10 دقائق.

في هذه الأثناء، قم بتحضير ثلاثة مليلترات من حبيبات الستربتافيدين البارامغناطيسية أو SMB في المنظم C. بعد الحضانة، أضف معلق SMP إلى خليط تفاعل الترجمة. حضّن المعلق الجديد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. افصل SMB من الخليط عن طريق تسليط مجال مغناطيسي باستخدام حوامل الفصل المغناطيسي. أعِد التعليق.

قم بتعليق الـ SMB في المنظم C وافصل الخرزات مرة أخرى باستخدام الحامل المغناطيسي. بعد تكرار إجراء الغسيل هذا مرتين، أعد تعليق الخرزات في 500 microliters من المنظم C. احفظ المعلق على الثلج ونفذ الإجراء التالي فوراً. لتصور الـ peptid TRNA، اخلط 10 microliters من الـ SMB المعلق والمنظم C مع 10 microliters من منظم التحميل، ثم قم بفصل المكونات المرتبطة بالخرزات عن طريق تشغيل العينات في هلامات poly acrylamide بتركيز 10%Tris tric.

جفف الهلامات باستخدام مجفف هلام تفريغي. ثم تحقق من سلامة ونقاء الببتيد TRNA عن طريق تعريض الهلام المجفف لفيلم الأشعة السينية. ولتحليل الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي، اخلط 190 µL من محلول EDTA بتركيز 2 mM المحضر بماء معالج بـ dpci، و 200 µL من الفينول المساوي للماء و 10 µL من معلق حبيبي.

اخلط المعلق الناتج عن طريق الرج العنيف باستخدام جهاز الفورتكس. افصل الطور غير العضوي عن الطور العضوي بواسطة الطرد المركزي عند 10,000 Gs لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم اجمع الطبقة المائية العلوية في أنبوب دقيق جديد، ورسّب الـ RNA من الطبقة المائية بإضافة عُشر الحجم من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 molar و pH 5.2، و 1 microliter من محلول الجليكوجين بتركيز 20 milligrams per milliliter، وحجمين من الإيثانول المبرد بالثلج. أعد تعليق الـ RNA المترسب في 10 microliters من الماء المعالج بـ dpci.

تحقق من سلامة الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي (ribosomal RNAs) عن طريق الرحلان الكهربائي على هلامات النيروز. عادةً ما ينتج عن 50 µL من معلق الخرز ميكروجرام واحد من الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي. تُعرض هنا نتائج سلسلة من التحليلات التي تقيم جودة ووظيفية الريبوسومات المترجمة والمعزولة.

يشير رصد حزمة فريدة تم فصلها في هلامات بولي أكريلاميد إلى وجود ببتيدات متعددة مرتبطة بـ mRNAs المسمى بالبيوتين والمتصلة بـ SMB. كما أن تنقية الحمض الريبي النووي الريبوزومي (ribosomal RNAs) باستخدام هذا الإجراء يثبت وجود الريبوزومات المرتبطة بهذه الـ mRNAs المسمى بالبيوتين أيضاً.

يؤدي إضافة pur mycin، وهو مضاد حيوي يحفز نشاط peptid transferase في الريبوسوم، إلى شطر peptid tRNAs الناشئة. ويظهر ذلك على شكل إزاحة في نمط هجرة الببتيد المتعدد المعزول في هلامات poly acrylamide. وتشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن mRNAs الموسومة بالبيوتين والمرتبطة بـ SMB تحتوي على ريبوسومات وظيفية مع peptid tRNAs.

يسمح عزل الريبوسومات المترجمة التي تحتوي على tRNA ببتيدي محدد بدراسة تأثيرات الـ tRNA الببتيدية والمضادات الحيوية والجزيئات الأخرى على وظيفة الريبوسوم وبنيته. في الأمثلة المعروضة هنا، يعمل المضاد الحيوي parsamyn والحمض الأميني trytophan على تثبيط الانقسام التحللي للـ tRNA الببتيدي الناشئ TNAC بواسطة RF two في الريبوسومات المعزولة.

يؤدي تفاعل التريبتوفان أو السبارسميسين مع الريبوسوم أيضاً إلى إحداث تغييرات هيكلية في بعض النيوكليوتيدات التي تشكل 23 S-R-R-N-A في الريبوسوم المترجم. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجاز الجزء الرئيسي منها في غضون خمس ساعات إذا تم اتباع هذه الإجراءات بشكل صحيح. ويمكن إجراء طرق أخرى مثل cryo em كتحليلات هيكلية إضافية للإجابة على تساؤلات أخرى حول بنية الريبوسوم الذي يحتوي على Pepin, RNA فريد.