فأري عزل جزيرة البنكرياس

مرحبا ، أنا جريج زوت. أنا مع مركز السكري بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو في مختبر بلوستون ، واليوم سأوضح لكم عملية عزل ثقوب الفئران. يتضمن الإجراء حقن محلول كولاجيناز في بنكرياس فأر متبرع C3 H ، حيث سنقوم بعد ذلك بإزالة هذا البنكرياس ، وهضمه بعيدا ، وتنقية الثقوب على تدرج الوجه ، ثم انتقاؤها يدويا للزرع النهائي في كبسولة الكلى لفأر NOD المصاب بالسكري ، والذي سيكون متلقينا.

قبل أن نبدأ هذا الإجراء ، قمنا بتخفيف محلول ATE الخاص بنا في مخزن هانكس المعدل وقمنا بتعديل التركيز المحدد لسلالة الفأر التي نستخدمها C3 H ، ووجدنا أن الهضم أفضل عند محلول الكولاجيناز 0.8 مجم لكل مل ، وسنستخدم ذلك للحقن في القناة الصفراوية المشتركة لتوسيع البنكرياس. اداء. سيكون الإجراء اليوم هو Pavo codre من مركز السكري. سيقوم بالحقن ، وفتح الفأر ، وفضح الأمعاء ، ثم الحقن في القناة الصفراوية المشتركة.

سنقوم برش الماوس بالإيثانول للحفاظ على الشعر منخفضا ، وبعد ذلك سنتحقق أيضا من التضحية بالفأر بشكل صحيح مع قرصة إصبع القدم. سيقوم بافو الآن بفتح الفأر وتعريض الأمعاء والبنكرياس بشق خط الوسط. سيتم أيضا قطع الحجاب الحاجز للتحقق من التضحية بالماوس.

قبل أن نبدأ ، أود أن أشير إلى بعض الهياكل المهمة. المعدة ملقاة هنا مع ربط البنكرياس تحتها بالاثني عشر وما فوقها. هذا هو الكبد حيث سنجد المرارة والقناة الصفراوية المشتركة ، والتي يمكنك رؤيتها هنا.

لذا فإن ما سيفعله بافو بعد ذلك هو أنه سيعزل الأمعاء الدقيقة ، ويجد مكان دخول القناة الصفراوية المشتركة إلى الأمعاء الدقيقة. بمجرد أن تتعرض الأمعاء ، نقوم بتثبيتها على جانبي القناة الصفراوية المشتركة بمشابك البعوض. نجد أن هذا يسمح لمزيد من الكولاجينات بدخول البنكرياس بينما تحاول المجموعات الأخرى توجيه المشبك أعلى القناة الصفراوية المشتركة.

وجدنا أن هذه تقنية أفضل للسماح للإنزيم بدخول البنكرياس. هذا إجراء لطيف. أنت لا تريد تمزيق الأمعاء.

تريد السماح للمشابك بالاستلقاء برفق على جانبي القناة الصفراوية المشتركة. الآن سنجد المرارة ، وبمجرد أن تتعرض المرارة ، سنستخدم ذلك كدليل لحقن الكولاجيناز في القناة الصفراوية المشتركة. يستخدم باول إبرة قياس 30 مع حقنة سعة خمسة سم مكعب تحتوي على ثلاث مطاحن من محلول الكولاجيناز.

أثناء دخوله إلى القناة الصفراوية المشتركة ، يقوم بتوسيع تلك القناة بمحلول الكولاجيناز ثم ينتقل إلى أسفل القناة الصفراوية المشتركة حتى يصل بالقرب من الأمعاء. وأثناء نزوله ، يتم ضخ محاليل الإنزيم في البنكرياس. الآن بعد أن تم نفخ البنكرياس بمحلول الكولاجيناز ، سيقوم باول بإزالة المرقئ ثم إزالة البنكرياس من الفأر وتمزيقه بعناية بعيدا عن الأمعاء.

يزيله من المعدة. حسنا ، ثم باستخدام الطحال كمقبض ، يرفع البنكرياس ثم يقصه ببطء بعيدا في القناة الصفراوية المشتركة ، وهذا كل شيء. يتم وضع البنكرياس ثم تتم إزالة الطحال ، وهناك يقوم بإزالة الأنسجة المعوية المتوسطة ، ثم يتم وضع البنكرياس في محلول كولاجيناز من مطحنتين وقارورة زجاجية معقمة ويتم وضعها مرة أخرى على الجليد.

الآن وضع البنكرياس المعزول الذي نضعه في القوارير الزجاجية في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة لمدة 17 دقيقة تقريبا. وضعناها في رف مخروطي سعة 50 مل حتى لا تطفو. مرة واحدة أثناء الاستحمام ، يبدأ المؤقت ويبدأ الهضم.

بمجرد اكتمال وقت الهضم ، تتم إزالة القوارير ، ثم يتم رجها وتعطيلها برفق. وبمجرد أن تبدأ الأنسجة في الانهيار ، يتم وضع القارورة على الجليد. يتم وضع حاجز معقم فوق دورق 400 مل يحتوي على عازل غسيل.

ثم يسكب هضم البنكرياس بعناية على الشاشة في مخزن الغسيل. لأغراض العرض التوضيحي ، تم إيقاف تشغيل غطاء المحرك ورفع زجاج غطاء المحرك حتى نتمكن من رؤية ما نقوم به. بمجرد سكب هضم البنكرياس في الدورق ، يتم شطف القوارير بنفس مخزن الغسيل ووضع مخزن الغسيل فوق الشاشة.

لدينا حقنة مليئة بمخزن الغسيل. سنستخدم ذلك لغسل الأنسجة بقوة من خلال الشاشة. الفكرة هي تحرير أي ثقوب فضفاضة غير متصلة بالمصفوفة ، ولكن تترك الأغشية والأنسجة غير المهضومة على الشاشة.

وعندما تنتهي من غسل منديل ورقي ، هذا ما تراه عادة في نهاية الإجراء. سيتم الآن نقل أنسجة البنكرياس الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب إلى مخروطيين بحجم 50 مل ، وسيتم غسل الأنسجة ، وخلط الأنسجة بالتساوي ، ثم توزيعها بالتساوي بحيث يكون لدينا حجم حبيبات متساو في كل أنبوب. يتم الآن شطف الدورق بمزيد من المخزن المؤقت للغسيل.

يتم شطف الجوانب بحيث تحصل على جميع الأنسجة التي يتم إدخالها إلى الدورق مرة أخرى. ثم يتم توزيعها بالتساوي بين كل اثنين ، كلاهما 50 مل. ثم يتم تعلوها المخروطية مع مخزن مؤقت الغسيل.

يتم قلب الأنسجة عدة مرات ثم وضعها في جهاز طرد مركزي. هذا دوران سريع. يسمح لجهاز الطرد المركزي بالوصول إلى ألف دورة في الدقيقة ثم يتم إيقاف تشغيله.

الأنسجة في هذا الوقت شديدة الثقوب S حساسة للغاية ، ولا تريد أن تضغط عليها أكثر من اللازم. تتم إزالة الأنابيب وسنقوم بخطوة الغسيل هذه ثلاث مرات أخرى. هذه هي نهاية الغسالة الثالثة.

يتم نقل مكونات الأنبوب المخروطي سعة 50 مل إلى الأنبوب المخروطي 15 وجهاز الطرد المركزي لألف RP M ثم يتم إيقافها. ستتم إزالة السوبر وسيتم بدء الجزء الأول من مكالمة FI. نحن في الخطوة التي لدينا فيها هضم البنكرياس الحبيبي.

سنقوم بإعادة تعليق هذا النسيج بحيث يكون لطيفا وفضفاضا على الكريات. سنضيف أول تدرج للكثافة، وهو 1 1 0 8. سنضيف خمسة مل لكل أنبوب.

ثم يتم خلط الحبيبات جيدا في كل من التدرجات. من المهم أن تحصل على توزيع جيد للأنسجة في أثقل تدرج لديك. الآن سنقوم بطبقة ملتين من كثافة 1 0 9 6.

سنقوم بعد ذلك بطبقة ملين من الكثافة 1 0 6 9 ، ثم فوق الكثافة 1 0 3 7. من المهم أثناء وضع طبقات الكثافات التي لا تخلطها. ثم تمت إضافة جميع الطبقات إلى الأنبوب.

ويمكنك أن ترى أن هذا هو الجزء العلوي من 1 1 0 8 ، الجزء العلوي من 9 1 0 9 6 ، الجزء العلوي من 1 0 6 9 والجزء العلوي من 1 0 3 7. ويمكنك أن ترى أن الأنسجة بدأت بالفعل في التحرك إلى كثافتها المناسبة حتى بدون اندماج المركز. يتم رفع التدرجات الخارقة إلى السرعة عند 1800 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة ، وتذكر إبقاء الفرامل مطفأة بعد إزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي.

يمكنك أن ترى بين الطبقة 0 0 9 6 و 0 0 7 ، هناك شريط جميل من أنسجة العيينة بابلو. الآن إزالة الطبقة 0 3 7 لإزالة أي بقايا أنسجة وحمض نووي ربما تم إطلاقه أثناء المعالجة. باستخدام ماصة المراعي البلاستيكية المعقمة ، سيقوم الآن بإزالة طبقة الجزيرة ونقلها إلى مخروطي الشكل سعة 50 مل يحتوي على 25 مل من محلول الغسيل.

تريد القيام بهذه الخطوة بسرعة لأن فول سام للثقوب. لقد أزلنا بالفعل الطبقة 0 و 6 و 9 و 0 9 6 بأكملها. يقطع Pavo الجزء العلوي من ماصة المراعي البلاستيكية ويشطفها بمحلول الغسيل.

ثم يتم الطرد المركزي للثقوب كما كنا أجهزة الطرد المركزي سابقا. يتم رفع جهاز الطرد المركزي إلى ألف دورة في الدقيقة ثم نوقفه ونستنشق. سيتم غسل الثقوب الطافية ثلاث مرات باستخدام وسائط الغسيل.

لذلك أكملنا للتو عملية عزل الجفن التي أخذناها من الملخص إلى التدرج إلى الثقوب المنقاة بعد غسلنا الثالث باستخدام المخزن المؤقت للغسيل ، وقمنا بتعليق الثقوب في وسائط RPMI الخاصة بنا وقمنا بتشغيلها في لوحة زراعة الأنسجة. هذه الثقوب جاهزة الآن للمقايسات في المختبر أو في الجسم الحي مثل زرع العيينة.