العزلة والثقافة في خلايا كلوية المنشأ من منطقة من الفأر الجنينية الكلى

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مزرعة أولية لخلايا المنطقة المكونة للكلى من الكلى النامية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الكلى من أجنة في اليوم 17.5. والخطوة التالية من الإجراء هي إزالة محفظة الكلية.

يتم بعد ذلك إجراء هضم إنزيمي محدود للأعضاء لفصل الخلايا الميزنشيمية للقلنسوة وخلايا السدى القشرية عن المنطقة المولدة للكلى. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في زرع الخلايا في الفبرونكتين واستنباتها في وسط خالٍ من المصل. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تثبت وجود تجمّع خلوي نقي من المنطقة المولدة للكلى عن طريق التلوين المناعي لعلامات محددة.

على الرغم من إمكانية استخدام هذه الطريقة لدراسة تأشير الخلايا، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً لفهم متطلبات الركيزة اللازمة للتوسع الخلوي. على سبيل المثال، بالنسبة لتقنيات التطعيم، سيقوم بشرح الإجراء كل من Derek Adams، وهو فني في مختبري، وAaron Brown، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري. بعد تحضير المحاليل اللازمة ومعالجة أطباق زراعة الأنسجة وفقاً للبروتوكول المكتوب، ابدأ بتشريح كلية الجنين للفأر عن طريق تضحية الأم عند المرحلة E 17.5.

وفقاً للإرشادات المؤسسية الخاصة بك، قم بإزالة الرحم ووضعه في أطباق بتري تحتوي على عدة ملليلترات من المحلول الملحي المنظم أو DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. وباستخدام مجهر تشريحي، استخدم ملقط الساعات لإزالة كل جنين، وزوجاً آخر من الملاقط لقطع الرؤوس. وبمجرد إزالة جميع الأجنة من الرحم وقطع رؤوسها، انقل الأجنة إلى طبق بتري نظيف يحتوي على كمية كافية من DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم لتغطية الأجنة.

اترك أكبر قدر ممكن من الدم وبقايا الأنسجة لكل جنين، ثم استخدم الملاقط لإجراء شق دائري في جدار البطن عند مستوى السرة. بعد ذلك، ضع الجنين على ظهره وثبّت الكتفين بمجموعة واحدة من الملاقط. وباستخدام مجموعة ثانية من الملاقط، قم بإزالة الأعضاء الداخلية بدءاً من الرئتين وصولاً إلى المثانة.

ستكون الكليتان متصلتين بالجزء الخلفي من كتلة الأعضاء الداخلية. بعد ذلك، قم بفصل الكليتين برفق عن بقية الأعضاء، مع الحرص على إبقائهما متصلتين ببعضهما البعض.

ثم أمسك النسيج الموجود بين الكليتين بمجموعة واحدة من الملاقط، وامسك الغدة الكظرية الملتصقة بالمحفظة في إحدى الكليتين بالملاقط الأخرى. قم بتقشير المحفظة عن الكلية برفق. احرص على عدم إتلاف الكلية.

تأكد من إزالة أي بقايا للمحفظة من الكلية وكذلك من الرحم إذا كانت لا تزال متصلة. كرر العملية مع الكلية المتبقية. أخيراً، اقطع ماصة نقل للحصول على قطر مناسب وانقل الكليتين برفق إلى أنبوب بوليسترين سعة 5 mL يحتوي على HBSS.

كرر عملية عزل الكلى لكل جنين، واجمع الكلى في الأنبوب بحيث لا يتجاوز عدد الكلى ثماني كلى لكل أنبوب في بيئة معقمة. ابدأ عملية الهضم الإنزيمي أولاً بإزالة محلول HBSS من أنبوب الخمسة مليلتر الذي يحتوي على الكلى باستخدام ماصة. احرص على تجنب ملامسة الكلى، ثم أضف فوراً 1.5 مليلتر من الكولاجيناز، وهو محلول هضم Pancreatin.

كرر العملية لكل أنبوب من أنابيب الكلى ثم أغلق الأنابيب. بعد ذلك، ضعها على جهاز هزاز في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة Celsius لمدة 15 دقيقة. وقبل انتهاء فترة التحضين مباشرة، أضف ثلاثة µL من DNAs بتركيز وحدة واحدة لكل µL إلى أنبوب بوليسترين جديد سعة خمسة mL لكل عملية هضم يتم إجراؤها.

بعد انتهاء فترة الحضن، أخرج العينة المهضومة بسرعة من الحاضنة وأضف 75 µL من FBS ثم اقلب الأنبوب ثلاث مرات للمزج. واترك العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد ذلك، انقل 1.4 mL من معلق الخلايا إلى أنبوب بوليسيتيرين سعة 5 mL يحتوي على DNAs Mix، وضعه على جهاز هزاز في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 10 دقائق.

بعد انتهاء فترة الحضن، يتم نقل كل معلق خلوي إلى أنبوب إبندورف سعة 1.5 milliliter، ثم يُوضع في جهاز الطرد المركزي بسرعة 325 ×g لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم إزالة الراسح، ثم تُطرد الأنابيب مركزياً مرة أخرى بسرعة 325 ×g لمدة خمس دقائق. وأخيراً، يتم إعادة تعليق الراسب في 1 milliliter من 5% FBS في محلول HBSS عن طريق السحب والضخ بالماصة من خمس إلى ست مرات.

قم بتغطية كل أنبوب قبل الانتقال إلى العينة التالية. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة SNAT وأضف 500 µL من KSFM مع الإضافات إلى كل أنبوب بعد إضافة الوسط إلى جميع الأنابيب. أعد تعليق كل كتلة خلوية بلطف عن طريق السحب والضخ خمس إلى ست مرات باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 mL. اجمع كافة المعلقات الخلوية في أنبوب بوليسترين جديد سعة 5 mL.

قم الآن بترشيح معلق الخلايا عبر غطاء مصفاة خلايا بمسامية 40 ميكرون مبلل مسبقاً، واجمع السائل المُرشح في أنبوب بوليسترين جديد. تجنب لمس المصفاة بطرف الماصة بمجرد جمع كل السائل المُرشح. أعد ترشيح السائل المُرشح مرة ثانية عبر مصفاة خلايا جديدة مبللة مسبقاً.

أزل المصفاة وأغلق الأنبوب بغطاء معقم جديد مأخوذ من أنبوب آخر. قم بعدّ الخلايا ثم ازرعها بكثافة تتراوح بين 100,000 إلى 200,000 خلية لكل سنتيمتر مربع في وسط KSM مع الإضافات في طبق زراعة مرمز بالألياف. اترك خلايا المنطقة الكلوية (nephrogenic zone) لتتعافى وتلتصق في حضانة مرطبة عند 37 درجة Celsius و5% carbon dioxide لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات قبل البدء بأي تحفيز لأغراض التجربة.

تظهر هنا صورة مجهرية بتباين الطور (phase contrast) بتكبير 20x لخلايا المنطقة الكلوية (nephrogenic zone) التي تم زرعها بكثافة 200,000 خلية لكل سنتيمتر مربع واستُزرعت لمدة 24 ساعة. في هذه الصورة، صُبغت خلايا المنطقة الكلوية باستخدام جسم مضاد لـ PAX2، وهو جسم مضاد متخصص في الخلايا السلفية للكلية ويظهر باللون الأحمر، بينما صُبغت النوى باللون الأزرق باستخدام صبغة dapi.

تظهر رؤية بتباين الأطوار لمجموعة من سلائف الكبيبات الكلوية بتكبير 40x. ولإثبات النوعية بشكل أكبر، تم عزل خلايا المنطقة الكلوية من أجنة تعبر عن laxy تحت تحكم محفز Fox D one، والذي يتم التعبير عنه في مجموعة الخلايا السدوية. بعد ذلك، صُبغت الخلايا داخل المنطقة الكلوية للكلية النامية باستخدام DAPI لتلوين النوى باللون الأزرق، و phalloidin لبروتين F actin باللون الأخضر، و anti beta lactase باللون الأحمر.

بمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إنتاج مزرعة أولية أحادية الطبقة من خلايا المنطقة الكلوية في غضون ساعتين تقريبًا. وتسهل هذه المزارع إجراء دراسات سريعة وعالية الإنتاجية لمسارات إشارات الخلايا في تطور سلائف الكلية، كونها مهيأة للغاية لعمليات نقل الفيروسات والمعالجة بالبروتينات المؤشبة والمعالجة بالجزيئات الصغيرة. كما يمكن استخدام إجراءات إضافية لفرز الخلايا لعزل أنواع محددة من الخلايا من هذه المزارع.