تعديل ES / OP9 المشارك الثقافة ينص البروتوكول خصائص محسنة من النسل للدم

الهدف العام من التجربة التالية هو تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفئران إلى سلالات مختلفة من الخلايا المكونة للدم البدائية والنهائية. ولتوصيف جميع النواتج المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية، يتم تحقيق تمايز الخلايا المكونة للدم في الفئران عن طريق وضع الخلايا الجذعية الجنينية على طبقة متلاحمة من خلايا OP nine السدوية المسمى فلوروسنتياً بـ M strawberry. ويمثل كل يوم من أيام التمايز أو الزراعة المشتركة المراحل المختلفة للتطور المكون للدم في وقت الحصاد المناسب.

يمكن فصل نسل الخلايا الجذعية الجنينية (ES cell) المتمايزة عن الخط الخلوي السدوي M strawberry OP nine عن طريق فرز الخلايا. يُحاكي بروتوكول تمايز الخلايا الجذعية الجنينية هذا عملية تكوين الدم البدائية والنهائية كما تُلاحظ في الجسم الحي، ويمكن استخدامه لتوصيف عيوب تكوين الدم المرتبطة بخطوط الخلايا الجذعية الجنينية المعطلة جينياً (knockout) دون الحاجة إلى استخدام الأجنة. مرحباً بكم في مختبر الدكتورة جوديث غاسن في مركز جونسون الشامل للسرطان بجامعة كاليفورنيا لوس أنجلوس (UCLA).

اسمي أليسيا بوز. الميزة الرئيسية للتقنية التي سأعرضها لكم اليوم مقارنة بطرق الزراعة المشتركة الحالية لـ ESO nine هي أن هذا الإجراء يسمح بتمرير جميع خلايا اليوم الخامس واليوم الثامن، بالإضافة إلى الفصل الكامل لجميع السلالات المشتقة من ES. ومن السدى Nine M، تُزرع خلايا strawberry OP nine في وسط زراعة خلايا OP nine، والذي يجب تغييره كل يومين.

يجب استزراع خلايا OP nine فرعياً قبل ثلاثة أيام من الموعد المطلوب لاستخدامها في الزراعة المشتركة. ومن المهم ملاحظة أنه خلال فترة الصيانة، يجب ألا يتم الحفاظ على خلايا OP nine بكثافة تتجاوز 90% من درجة تلاقي الخلايا. أولاً، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS، ثم أضف 0.1% trypsin EDTA المسخن مسبقاً لمدة خمس دقائق حتى تنفصل الخلايا. أضف وسط استزراع خلايا OP nine وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.

قم بترسيب الخلايا في الأنبوب عند 300 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد عملية الطرد المركزي، وتخلص من السائل الطافي ثم أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة خلايا M strawberry OP nine جديد. ازرع الخلايا بكثافة لا تقل عن 10⁴ خلية/سم² في اليوم الذي تبدأ فيه تجربة الزراعة المشتركة. يجب أن تكون خلايا OP nine التي تم استزراعها قبل ثلاثة أيام متلاحمة. كما يجب زراعة خلايا ES وفقاً للبروتوكول القياسي الخاص بسلالة الخلايا المستخدمة.

اغسل خلايا ES مرتين باستخدام PBS، ثم قم بهضمها باستخدام 0.25% tryin EDTA واحضنها لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك، أضف وسط تمايز الزراعة المشتركة إلى خلايا ES وانقلها إلى أنابيب مخروطية سعة 15 milliliter. قم بترسيب خلايا ES عند 400 G لمدة تتراوح من خمس إلى سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد إزالة السائل الطافي، قم بإعادة تعليق خلايا ES في وسط تمايز الزراعة المشتركة. استخدم إبرة ذات طرف غير مدبب بقياس 21 gauge للحصول على معلق من الخلايا المفردة. قم بعد الخلايا باستخدام صبغة tripan blue ومقياس كرات الدم (hemocytometer).

الآن قم باستعادة قارورة M strawberry. وأخرج خلايا OP nine من الحاضنة. قم بإزالة الوسط من خلايا OP nine وأضف وسط تمايز الزراعة المشتركة إلى طبق القارورة.

أضف 1×10³ من الخلايا الجذعية الجنينية (ES cells) لكل سنتيمتر مربع إلى كل دورق من خلايا M strawberry OP9. يتم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية، و5% من ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. يمثل هذا اليوم صفر، ويجب أن يبدو المستنبت المشترك بهذا الشكل. بعد ثلاثة أيام من بدء المستنبت المشترك بين خلايا ES وخلايا M strawberry OP9.

يُلاحظ وجود تجمعات مسطحة كبيرة غالباً من السلالات المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية (ES) ذات حدود محددة، وقد تبدأ بعض الدوامات الخلوية في التشكل. قم بإزالة الوسط من المزرعة المشتركة بعناية واستبدله بوسط تمايز جديد بعد مرور خمسة أيام من بدء المزرعة المشتركة. يجب أن يؤدي التمايز السليم لخلايا ES على طبقة متصلة من خلايا M strawberry OP nine إلى تكوين أرومات دموية (heman eblasts)، والتي تظهر على شكل كتل خلوية متراكمة.

إن الجانب الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو التأكد من تحقيق تمايز سليم في اليوم الخامس من الزراعة المشتركة. في هذه المرحلة، يمكنك رؤية مستعمرات أرومات الخلايا البشرية ليس مجهرياً فحسب، بل وعيانياً أيضاً. اغسل الزراعة المشتركة بعناية مرتين باستخدام PBS، ثم قم بهضم الخلايا باستخدام 0.25%tripsin EDTA، واغسل الخلايا من الدورق باستخدام وسط تمايز ES وانقلها إلى أنبوب، ثم قم بترسيب الخلايا عند 400 G لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي وأضف وسطاً غذائياً جديداً. ثم استخدم إبرة ذات طرف غير مدبب بمقياس 21 لإعادة تعليق الخلايا، ولضمان الحصول على معلق خلوي مفرد، قم بعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)؛ حيث يجب أن تكون هناك زيادة بمقدار 100 إلى 150 ضعفاً في عدد خلايا ES مقارنة باليوم صفر. أعد زراعة خلايا الزراعة المشتركة على طبقة جديدة من خلايا M strawberry OP nine الملتصقة تماماً في اليوم الثامن أو التاسع، وفي اليوم 12، قم بعد الخلايا مرة أخرى. قم بإزالة الوسط الغذائي الذي يحتوي على الخلايا المكونة للدم واحتفظ به.

اغسل الطبقة أحادية الخلية مرة واحدة بـ PBS. لإزالة الخلايا المكونة للدم العالقة والاحتفاظ بها، أضف 0.25%tripsin EDTA إلى القارورة، وبعد التصاق الخلايا بالتربسين، اغسل الخلايا من القارورة باستخدام وسط تمايز ES وأضفها إلى الخلايا المكونة للدم الموجودة في العالق. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 400 G لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، أعد تعليق الخلايا باستخدام إبرة ذات نهاية غير مدببة بقياس 21 gauge وقم بعدّ الخلايا. الآن أصبحت الخلايا جاهزة لإعادة الزرع أو الاستخدام في المقاييس اللاحقة.

يمكن استخدام نظام الزراعة المشتركة للخلايا الجذعية الجنينية (ES) وخلايا M strawberry OP nine لنمذجة التطور المكون للدم الموضح. إليكم نظرة عامة على الجدول الزمني للزراعة المشتركة، حيث يتم تحديد الأيام التي يجب فيها نقل سلالات الخلايا الجذعية الجنينية المتمايزة إلى خلايا M strawberry OP nine جديدة. سيؤدي التمايز الصحيح للخلايا الجذعية الجنينية على طبقة متصلة من خلايا M strawberry OP nine إلى إنتاج flick one positive.

تظهر الأرومات الوعائية في اليوم الخامس من الزراعة المشتركة؛ حيث تُعد الخلايا العظمية البشرية سلائف ميزودرمية مشتركة للسلالات البطانية والمكونة للدم، ويجب أن تظهر على شكل دوامات خلوية متراكمة كما هو موضح في هذه الصورة. ومع استمرار الزراعة المشتركة، تظهر تجمعات مكونة من خليتين إلى أربع خلايا في اليوم السادس أو السابع وتنمو لتصبح تجمعات خلوية أكبر. وبحلول اليوم الثامن أو التاسع، تكون السلائف المكونة للدم قد ظهرت بالفعل في اليوم السادس، بينما تظهر السلالات المكونة للدم والمتمايزة نهائياً بحلول اليوم 14.

على النقيض من ذلك، فإن الزراعة المشتركة التي تعاني من تمايز غير صحيح للخلايا الجذعية الجنينية (ESL) ستؤدي إلى سلالات مشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية لا تظهر في نمط عالمي (world pattern) في اليوم الخامس. ويشير غياب الخلايا في النمط العالمي إلى تكوين غير صحيح للأرومات الغازية (GIO blasts). إن الزراعة المشتركة التي تفتقر إلى تكوين سليم للأرومات الجنينية (eblasts) ستؤدي في النهاية إلى تعثر تمايز السلالة المكونة للدم، ويجب التخلص منها وفقاً لبروتوكول الزراعة المشتركة المعدل لـ ES OP nine.

تكون السلالات المشتقة من ES سالبة لـ m strawberry ويمكن فرزها بالتدفق الخلوي من السلالات الموجبة لـ M strawberry. يتم التقاط تسع خلايا في أي يوم من أيام الزراعة المشتركة لتقييمها. النتائج الموضحة هنا هي من تجربة تمثيلية.

ركزت تسعة بروتوكولات سابقة للزراعة المشتركة لـ ES OP حصراً على تمرير وتقييم الخلايا العائمة غير الملتصقة. أما في هذا البروتوكول المعدل، فيتم تمرير وتقييم جميع الخلايا المشتقة من ES، سواء كانت الخلايا الملتصقة أو غير الملتصقة. ويؤدي ذلك إلى زيادة إنتاجية الخلايا المكونة للدم، ويسمح بتحديد مجموعات نادرة من الخلايا، كما يتيح التوصيف الكامل لجميع سلالات ES، سواء المكونة للدم أو غير المكونة للدم.