تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

اسمي أليسون كلافون، وأعمل مساعدة باحث مع الدكتور أليكس بيشوب في معهد غري لأبحاث سرطان الأطفال في مركز جامعة تكساس للعلوم الصحية في سان أنطونيو، تكساس. سأقوم اليوم بشرح كيفية تشريح عين القارض لاستخراج كمية كاملة من الظهارة الصبغية الشبكية.

تعتبر هذه الأنسجة ذات أهمية لدراسة تطور الشبكية والأمراض المصابة بها، كما أنها تمثل موقعاً لاختبار إصلاح الحمض النووي الموجه بالتماثل في الجسم الحي. لذا، فلنبدأ العمل. إليكم هنا عيناً جاهزة للتشريح.

أولاً، دعونا نلقي نظرة على التراكيب التشريحية التي ستستخدمونها كعلامات استدلالية طوال الإجراء. هذه عين من حيوان مخدر. وهنا العصب البصري في الجزء الخلفي من العين في الجهة المقابلة.

هذه هي القرنية. تظهر القزحية من خلال القرنية. أما المنطقة البيضاء في الجزء الخلفي من العين فهي الصلبة.

لذلك، تُسمى هذه المنطقة بالحد الفاصل بين القرنية والصلبة. وتتمثل الخطوة الأولى من عملية التشريح في إزالة الأنسجة الزائدة، مثل الأنسجة الضامة للعضلات والعصب البصري. بعد ذلك، يجب إزالة القرنية عن طريق إجراء قطع دائري.

في هذه المرحلة، يمكن إخراج العدسة مما ينتج عنه تجويف للعين. بعد ذلك، يتم إجراء أربعة شقوق من الفاصل القرني الصلبي باتجاه رأس العصب البصري. ويشبه الهيكل الناتج زهرة ذات أربع بتلات.

يتم بعد ذلك قص كل بتلة من هذه البتلات الأربع من المنتصف، مما ينتج عنه هيكل يشبه زهرة ذات ثماني بتلات. في هذه المرحلة، قد تتقوس المادة في بعض المناطق بسبب طبيعتها الكروية. ولمعالجة ذلك وتحقيق تثبيت أكثر تسطحاً للفتحة، يمكنك إجراء ثمانية شقوق أقصر تتجاوز مناطق التقوس مباشرةً.

ستحتاج إلى توفير عدة مواد في محطة عملك، بما في ذلك ماصة سعة 100 أو 200 µL مع الرؤوس المناسبة لها، وأطباق X-P-B-S-A بقطر 35 مليمتر، وشرائح زجاجية وأغطية شرائح، وجلسرول بتركيز 90% وطلاء أظافر شفاف لتحضير الشرائح، وحامل لتجفيف الشرائح، وعلبة من مناديل Kim wipes، وحاوية للتخلص من النفايات. وبالإضافة إلى هذه المواد الشائعة، ستحتاج أيضاً إلى مجموعة من أدوات التشريح الدقيق المتخصصة، بما في ذلك ملاقط مستقيمة، وملاقط بزاوية 45 درجة تُستخدم للإمساك بالعين وتدويرها والتحكم بها بشكل عام طوال عملية التشريح. أما هذه الملاقط بزاوية 15 درجة فهي ذات زاوية مرتفعة وتُستخدم أيضاً للتعامل مع العين والتحكم بها.

أخيراً، ستحتاج إلى مقص نابضي. من المهم جداً استخدام المقص النابضي بدلاً من المقصات ذات النمط التقليدي. وفي هذا التشريح، وقبل البدء في عملية التشريح، تأكد من ضبط ارتفاع الكرسي بحيثما تكون عيناك في مستوى العدسات العينية عندما تجلس بظهر مستقيم.

يؤدي الانحناء أثناء استخدام المجهر إلى آلام في الكتف والظهر ويقلل من جودة عمليات التشريح. للبدء، صب كمية من XPBS في غطاء طبق قطره 35 مليمتر. ثم انقل العيون التي تخطط لتشريحها إلى الطبق.

هذه عين من فأر C 57 أسود من النوع البري. يمكنك أن ترى أنها صغيرة جداً، حيث يبلغ قطرها حوالي 3.5 ملم. وتمنحها عتامة الصلبة صبغة زرقاء.

تتمثل الخطوة الأولى في التشريح في إزالة جميع الأنسجة الزائدة من حول العين، مثل الأنسجة الضامة العضلية والعصب البصري. أحمل هنا ملقط 45 درجة في يدي اليسرى وملقط 15 درجة في يدي اليمنى. يمكنك استخدام زوج واحد من الملاقط لتثبيت العين بينما تقوم بسحب الأنسجة بعيداً باستخدام الزوج الآخر.

عندما تنفصل قطعة كبيرة من النسيج، امسح الملقط بعناية باستخدام منديل Kim wipe. فقط كن حذراً كي لا تسحق أو تثقب العين. إحدى فوائد إجراء هذا التشريح في حالة التعليق هي أنه يمكنك رؤية النسيج الضام وهو يطفو بعيداً عن العين بسهولة.

في النهاية، ستصل إلى نقطة لا يمكنك فيها إزالة أي أنسجة إضافية باستخدام الملاقط. استبدل الملاقط ذات الزاوية 15 درجة بمقصات الزنبرك. استخدم مقصات الزنبرك لقص العصب البصري.

استخدم الحافة الخارجية للشفرة لدفع الأنسجة للأمام باتجاه الحد الفاصل بين القرنية والصلبة. ثم قم بتشذيب المقص ومسحه برفق باستخدام منديل كيم وايب (kim wipe). لنلقِ نظرة على ذلك مرة أخرى.

ادفع النسيج للأمام باتجاه الحد الفاصل بين القرنية والصلبة باستخدام الحافة الخارجية للمقص عندما يكون النسيج بارزاً. قم بالقص، وواصل دفع أجزاء النسيج للأمام بالحافة غير الحادة للمقص ثم قصها حتى تتم إزالة جميع الأنسجة الزائدة. عادة ما يوجد شريطان من الأنسجة القوية على العين.

يتم تثبيت الجزء الأول عند الحد الفاصل بين القرنية والصلبة، بينما يظهر الجزء الثاني وهو يتم تشذيبه. تقع هذه النقطة في منتصف المسافة تقريباً بين الحد الفاصل بين القرنية والصلبة ورأس العصب البصري. الخطوة التالية في عملية التشريح هي إزالة القرنية والعدسة.

استخدم ملقط بزاوية 45 درجة لرفع شريحة في منتصف القرنية تقريباً. ثم استخدم مقص الزنبرك لإجراء شق صغير عند قاعدة الشريحة. أدخل الشفرة السفلية من المقص في الشق أسفل القزحية.

قم بإجراء قطع باتجاه الحد الفاصل بين القرنية والصلبة، ولكن دون الوصول إليه. الآن، قم بتدوير العين ببطء بمقدار 360 درجة، مع إجراء قطوع صغيرة على طول المحيط. حاول إبقاء المقص تحت القزحية، بحيث يتم قطع كل من القرنية والقزحية في آن واحد.

يتطلب الأمر الكثير من التدريب للقيام بذلك بالسهولة التي أعرضها هنا. بمجرد إزالة القرنية، أدر العين على جانبها واضغط برفق على الجزء الخارجي من العين لدفع العدسة إلى الخارج. سيكون الهيكل المتبقي على شكل كوب تالياً.

يجب تقسيم العين إلى أربعة أرباع. للقيام بذلك، أدر العين على جانبها وأدخل النصل السفلي لمقص الزنبرك. قم بإجراء قطع طولي باتجاه رأس العصب البصري، ولكن دون الوصول إليه تماماً.

للقيام بذلك، أبقِ ذراعيك بجانبك والمقص أمامك بحيث يكون متعامداً تقريباً مع جسمك ومع قطع العين. قم بإجراء القطع الثاني مباشرة في الجهة المقابلة للقطع الأول. تمهل في ضبط الاستقامة لتتمكن من إجراء قطع سلس.

يمكن أن يؤدي إجراء عدة قطوع إلى حدوث تشرذم، ولكن إذا تم محاذاتها بعناية فلن تكون ملحوظة؛ لاحظ كيف أستطيع التعامل مع الشكل الكروي للعين بدلاً من مقاومته لأن العين تحتفظ بشكلها الطبيعي. عند تعليقها في PBS، ستتم بقية عملية التشريح على شريحة. احمل العين باستخدام ملقط بزاوية 45 درجة وارفعها من محلول PBS.

ضع العين على شريحة نظيفة. وباستخدام زوجين من الملاقط المائلة، قم بفتح العين بعناية. لاحظ وجود هامش صغير من القرنية والقزحية حول محيط العين، وهو أمر مفيد عند التعامل معها.

بعد ذلك، يجب قطع كل بتلة من البتلات الأربع إلى نصفين. قم بتدوير العين بحيث تكون إحدى البتلات عمودية على جسدك. أمسك زاوية البتلة باستخدام ملقط بزاوية 15 درجة.

ارفع العينة قليلاً، ثم قم بإجراء قطع من الحد الفاصل بين القرنية والصلبة باتجاه رأس العصب البصري. يجب أن تكون هذه القطوع عمودية على المماس. والمماس هو خط يكون عمودياً على القطر.

وبناءً على ذلك، يجب أن تكون التقطيعات متماشية مع قطر العين. الآن، قم بتدوير الشريحة بحيث تكون الدواسة التالية عمودية على جسمك وكرر العملية. أمسك زاوية الدواسة.

ارفع قليلاً ثم قص. كرر العملية حتى يتم قص كل من البتلات الأربع الكبيرة إلى نصفين. المادة المبيضة هي الشبكية العصبية، والتي تكسو الظهارة الصبغية للشبكية (RPE) مباشرة.

يمكن للشبكية العصبية أن تحمي الظهارة الصبغية للشبكية (RPE)، لذا اتركها سليمة حتى تنتهي من جميع عمليات القص. لاحظ أن البتلات منحنية قليلاً، فلا تحاول مقاومة هذا الانحناء.

خذ وقتك في تحديد المحاذاة لضمان إجراء قطع واحد دقيق. ونظراً لأن العين مستديرة، فإنها تميل إلى الانثناء، ولتجنب هذا الانثناء، يمكنك إجراء ثمانية قطوع قصيرة.

واحدة على كل بتلة. استخدم نفس الاستراتيجية الأساسية المستخدمة في جولة القطوع الأربعة السابقة. ارفع زاوية البتلة وقم بالقص، ولكن في هذه الحالة، قص إلى منتصف طول البتلة تقريباً.

بمجرد الانتهاء من جميع القطوع، يمكنك إزالة الشبكية العصبية. أقوم هنا بإضافة بضع قطرات من 1xPBS إلى العينة؛ إذ يجب تجنب جفاف ظهارة الشبكية الصباغية (RPE).

يجب أن تكون الشبكية العصبية مرتبطة ارتباطاً فضفاضاً فقط بطبقة الظهارة الصباغية للشبكية (RPE) الكامنة تحتها. ويمكنك ملاحظة أنها تنفصل بسهولة تامة. ومع ذلك، فإنها تظل عادةً متصلة عند الحد الفاصل بين القرنية والصلبة، وهو عبارة عن حافة ناتئة في الجزء الداخلي من العين تسمى الجسم الهدبي.

يمكنك إدخال طرف ملقط بزاوية 15 درجة في رأس العصب البصري لتثبيت العينة أثناء نزع الشبكية العصبية. يحدد الجسم الهدبي حافة الـ RPE، وهي الأنسجة الداكنة الصبغية التي تم نزعها. هذا هو القزحية، وليس الـ RPE.

أوصي بإزالة أكبر قدر ممكن من القزحية لأنها لزجة للغاية ويمكن أن تنطوي وتلتصق بـ RPE إذا كانت الشبكية العصبية متقشرة أو إذا بقيت بقايا منها ملتصقة بـ RPE. من المحتمل أن يكون أحد أمرين قد حدث بشكل خاطئ؛ إما أن العيون لم يتم تثبيتها بشكل صحيح، كأن تكون فترة التثبيت طويلة جداً أو قصيرة جداً، أو أنها ظلت في التخزين لفترة طويلة جداً قبل التشريح.

إن الدواسة التي أكشف عنها هنا لم يتم تعيين اختصار لها بعد. يمكنك ملاحظة موقع الدواسة على بعد حوالي ثلث المسافة من حافة RPE. وهذا هو السبب في التوصية بالاختصارات الثمانية.

بمجرد التخلص من كل الشبكية العصبية، استخدم ماصة لشطف طبقة الظهارة الصباغية للشبكية (RPE) عدة مرات باستخدام 100 إلى 200 µL من PBS حتى تتم إزالة جميع الغبار والرواسب. ضع باستخدام الماصة من 80 إلى 90 µL من glycerol بتركيز 90% على شريحة جديدة على شكل مستطيل. ملاحظة: هذا هو الحجم الأمثل من glycerol لغطاء زجاجي بمقاس 22 في 50 millimeter ويجب تعديله وفقاً لذلك.

بالنسبة لأحجام أخرى من غطاء الشريحة الزجاجية، استخدم طرف الماصة لتوزيع الجلسرين. احرص على عدم إضافة فقاعات هواء إلى الجلسرين. وفي حال ظهور فقاعة، اسحبها نحو الحافة حتى تنفجر.

قم بتمرير الذراع السفلية لملقط الـ 15 درجة تحت ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) وارفعها بحذر، ثم أنزل الـ RPE ببطء في الجلسرول. ستطفو الـ RPE على سطح الجلسرول وقد تلتوي أو تنثني قليلاً. استخدم الملقط لتسوية الـ RPE وسحب الجلسرول فوق سطحها.

إذا تكونت أي فقاعات هوائية، قم بسحبها نحو الحافة حيث ستنفجر أثناء القيام بذلك، مع إمالة غطاء الشريحة بزاوية 45 درجة تقريبًا. ثم لامسه بحافة الجلسرول.

بعد ذلك، حركها نحو حافة الشريحة. أمسك الجزء السفلي من غطاء الشريحة بإبهامك وسبابتك، وثبّت الحافة المقابلة باستخدام ملقط بزاوية 15 درجة. اخفض غطاء الشريحة ببطء شديد نحو الشريحة بمجرد حدوث التلامس.

عند الوصول إلى RPE، توقف عن الخفض، واسمح للجلسرول بالانتشار ثم واصل خفض غطاء الشريحة ببطء. فإذا خفضت غطاء الشريحة بسرعة كبيرة، ستتكون فقاعات هوائية داخل الشريحة هنا. سأقوم بخفض غطاء الشريحة ببطء عند ملامسته لـ RPE للسماح للجلسرول بالانتشار.

يمكنكم ملاحظة أنه عند ترك غطاء الشريحة بسرعة، تتكون فقاعات هوائية. استخدم كمية وافرة من طلاء الأظافر الشفاف لتثبيت حافة الغطاء الزجاجي على الشريحة على طول المحيط بالكامل.

هذا ظهارة صبغية شبكية (RPE) نموذجية لفأر C 57 أسود. من الطبيعي رؤية الأوعية الدموية الكامنة كما هو موضح هنا. كما أنه من الطبيعي رؤية بعض التباين في التصبغ، مثل البقع التي تبدو أقل تصبغاً.

ومع ذلك، فمن المرجح أن تكون البقع الواضحة مثل هذه ناتجة عن تلف مادي في الظهارة الصباغية للشبكية (RPE) والمشيمية الكامنة أسفلها. ونظراً لأن مشيمية العين تكون مصبغة أيضاً، فمن الممكن ألا يكون التلف في الظهارة الصباغية للشبكية السوداء ملحوظاً إذا ظلت المشيمية سليمة.

هذا هو مظهر نموذجي لظهارة صباغية شبكية (RPE) من فأر مصاب بطفرة التخفيف (dilute mouse). وكما هو موضح، ستتمكن من رؤية الأوعية الدموية، وسيكون هناك بعض التباين في التصبغ مثل بقع داكنة وأخرى فاتحة. ومع ذلك، يكاد يكون من المستحيل رؤية التلف في ظهارة صباغية شبكية من فأر مصاب بطفرة التخفيف.

هل هذه البقع الصغيرة عبارة عن تلف أم أنها تباين طبيعي في التصبغ؟ أقترح إجراء عملية التثبيت والصبغ للإجابة على هذا السؤال، حيث سيمنحك ذلك فكرة عما إذا كنت تتعامل مع العينات بخشونة زائدة.

تحدد الصبغة بوضوح أغشية الخلايا، مما يجعل البقع المتضررة ظاهرة، ولكن في الواقع، فإن ظهارة الشبكية الصباغية (RPE) مرنة إلى حد ما، وإذا تعاملت مع العين من خلال القرنية، فمن غير المرجح أن تسبب ضرراً. إليك عينة تثبيت كاملة تعاني من مجموعة من المشكلات، أقلها ما هو موضح هنا وهو وجود هامش واسع جداً من القرنية، مما قد يؤدي إلى التجعيد وطي المادة المتعرجة. يمكنك أن ترى هنا وجود نسيج زائد ضخم متبقٍ على الجزء الخلفي من العين.

هذه الدواسة مطوية جزئياً، وهنا يمكنك أن ترى أن طبقة الظهارة الصبغية للشبكية (RPE) قد تمزقت جزئياً. وثمة مشكلة أخرى وهي أن هذه العين تظهر بمظهر يشبه عجلة الرياح. لقد قمت هنا برسم زوايا القطوع.

ومع ذلك، فهذا هو الشكل الذي ينبغي أن تكون عليه. تذكر أن تكون قطوعاتك عمودية على المماس وعلى استقامة واحدة مع القطر. لقد قمت للتو بشرح كيفية تشريح عين فأر لإجراء تحضير كامل لصبغة الشبكية.

بالنسبة للظهارة، فإن الأمر الأكثر أهمية هو الحفاظ على وضعية جسم جيدة، ولكن حاول أن تظل مسترخياً. آمل أن يكون هذا الفيديو مفيداً لكم وأتمنى لكم كل التوفيق في تجاربكم المستقبلية.