Name: مخيخي الثقافات عضوي النمط : التحديات والكشف عن أفكارك (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: اكتشف طريقة إعداد مزارع مخيخية نمطية عضوية لدراسة تأثير المحفز المستحث للموت الخلوي على خلايا المخيخ في الفئران البرية والمتحولة. تساعد هذه التقنية الباحثين على فهم آليات البقاء الخلوي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وقد تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل مؤسسة IPSEN. IMV هي جمعية السرطان الاميركية أستاذ البيولوجيا الجزيئية ، ويحمل الرئيس جاكوبس اروين وجوان في علوم الحياة المثالية. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ، ومؤسسة Leducq ، ومؤسسة Meriaux ، اليسون مؤسسة طبية ، Ipsen / Biomeasure ، سانوفي أفنتيس ، مؤسسة سرطان البروستاتا ، وHN وجيم فرانسيس مؤسسة بيرغر. وتمول من قبل PAS ماكنايت صندوق الهبات لعلم الأعصاب والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات (R01 DA019022). فإن الكتاب أود أن أشكر مارك شميت. وقد تم تصميم فن الجرافيك بواسطة جيمي T. سيمون. ويعود الفضل في الرعاية من قبل Invitrogen.

1. مخيخي الثقافات عضوي النمط : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد بنجاح الثقافات مخيخي عضوي النمط استخدام الفئران بين P3 - P0 أو P8 P12. لدينا تجربة استخدمنا الفئران في مجموعة P8 - P12 لأن هذه المرحلة التنموية وأكثر ملاءمة لدراستنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تشريح والمتوسطة الثقافة : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتنفذ تشريح الدماغ وإعداد شريحة في انخفاض الصوديوم السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) التي تحتوي على كلوريد الكالسيوم 1MM ، D - 10MM الجلوكوز ، 4mM كلوريد البوتاسيوم وكلوريد المغنيسيوم 5mM ، 26mM بيكربونات الصوديوم ، والسكروز 246mM والحل أحمر الفينول (1:1000) ، ودرجة الحموضة 7.3. لتعقيم الحل ، من خلال فلتر تصفية 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستزرع شرائح للدماغ في 75 ٪ من الحد الأدنى الأساسي النسر متوسطة (MEM) ، و 25 ٪ مصل الحصان الحرارة المعطل ، HEPES 25mM ، 1MM الجلوتامين ، والجلوكوز 5mg / مل ، البنسلين (100 U / مل) والستربتوميسين (100 U / مل). تصفية المتوسطة من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة أقصاها أسبوعين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الدماغ في الجليد الباردة المتوسطة ACSF انفجر في وقت سابق مع كربوجين (95 ٪ أكسجين و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون) لاحظ ، من شأنها أن تشبع كربوجين مع تغيير الرقم الهيدروجيني من الحل لذلك سوف تحول من اللون الأحمر إلى البرتقالي. وينبغي إجراء التشريح في كمية وقت ممكن الدنيا والحرص على عدم الاضرار بنية الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة الدماغ في الفروع من 400 ميكرومتر السهمي باستخدام vibratome. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اجراء خفض السهمي بشفرة حلاقة في نصف الكرة الجنوبي ، في محاولة لخفض أقل قدر ممكن من المخيخ ، وهذا سيوفر على سطح مستو لتقطيع. وتستخدم القشرة فقط للحصول على الدعم لجعل التقطيع اسهل ولكن منذ زمن مسألة هامة وهو أكثر ملاءمة لقطع النصف من القشرة منقاري بشفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام cyanoacrylate (Superglue) لإصلاح الموقف من الدماغ على صفيحة معدنية vibratome. من المهم أن البرد لوحة على الجليد قبل إضافة الغراء وانتشاره بشكل جيد باستخدام غيض من أنبوب لتشكيل طبقة رقيقة لاصقة. إذا كان هناك فائض من Superglue ، فإنه سيتم فصل من لوحة عندما يتعلق الأمر في اتصال مع وACSF ستفقد العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة متصلة الدماغ إلى لوحة vibratome ، إضافة إلى ما يكفي من وسائل الاعلام ACSF تغطي الدماغ ووضع تحت الجليد لوحة لإبقائها باردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع شرائح 400 ميكرون ونقل لهم ماصة باستير البلاستيك (قطع رأس لتوسيع وتفادي الأضرار التي لحقت شرائح) لوحة خلية ثقافة 6 - جيدا ACSF تحتوي على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل المخيخ عن بقية الدماغ بمساعدة الأنسولين المحاقن اثنين (المحاقن مع القطر الصغير عيار 28 إبر) تحت مجهر تشريح. وسوف يكون بعض شرائح Superglue تعلق على الحواف : هذا هو لحظة في محاولة لإزالته لأنها يمكن أن تؤثر على بقاء شريحة. من المهم أن تفعل ذلك دون الإضرار بعناية هيكل مخيخي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى 6 شرائح مخيخي رفاه لوحات تحتوي على لوحة 30mm إدراج الثقافة مع مسام ميكرون 0.4. إضافة 1 مل من وسائل الاعلام في الثقافة أيضا ، التي كانت ما قبل الحضانة مشروطا لمدة لا تقل عن 2 ساعة على 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 (في ثقافة الخلية الحاضنة). مكان يدرج على رأس وسائل الإعلام التأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحتبسة تحت ثم ضع شرائح مخيخي (1-3 في إدراج) على رأس إدراج التأكد يتم توسيع بشكل كامل ، وأنه لا يغطي السائل منها. نضح الزائدة من وسائل الإعلام إذا لزم الأمر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 تغيير ثقافة وسائل الإعلام كل يوم 2 أو 3. فمن الأفضل أن تحل محل جزء فقط من المتوسط ​​(على سبيل المثال حجم ونصف) في آن واحد ، لأن الوسيلة المستخدمة تحتوي على العوامل الغذائية المشتقة من شريحة التي تعتبر مهمة لبقاء الخلية. </li></ol> 2. معالجة فاس وتلون شرائح مخيخي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتجربة التحدي أفكارك ، ونحن أول من ثقافة شرائح لمدة 5 أيام المتغيرة وسائل الاعلام يوم في المختبر 3 (DIV3). يمكن DIV5 على الثقافات وتعامل مع 0.5 ميكروغرام / مل من الأضداد Jo2 فاس ناهض عن طريق إضافته مباشرة إلى وسائل الإعلام من أجل الحصول على خلفية نظيفة من موت الخلية منذ التغييرات من وسائل الإعلام لحث بعض الوفيات في الثقافات. يتم ترك نصف الآبار غير المعالجة والتحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة إزالة وسائل الاعلام تحت إدراج بواسطة الشفط. لإصلاح الشرائح ، إضافة 1 مل من الجليد الباردة PFA 4 ٪ و 1 مل تحت فوق إدراج. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة إزالة PFA وتغسل لفترة وجيزة مع PBS الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المقبل في برنامج تلفزيوني وإضافة (1) وتحت مل مل (1) أعلاه إدراج من الميثانول الجليد الباردة بنسبة 20 ٪ في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل و 1 مل تحت فوق إدراج 0.5 ٪ تريتون 100 - X في برنامج تلفزيوني عن permeabilization. احتضان مدة لا تقل عن 12 ساعة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد permeabilization ، كتلة مع جيش صرب البوسنة 20 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة لا تقل عن4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. ويمكن في هذه المرحلة أن تبقى الشرائح في حل حجب ما لا يقل عن 3 أيام في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل خفض وصمة عار على شرائح بعناية قطعة من الغشاء إدراج تعلق على شريحة مخيخي وتحويلها إلى 24 لوحات جيدة تحتوي على برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم immunostaining بالتسلسل ، الأولى مع كاشف النفق لمدة ساعة ثم مع Calbidin الأضداد بين عشية وضحاها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميكرولتر كاشف قبالة النفق في كل القرارات كذلك التأكد من أنها تغطي كامل سطح الشريحة. في احتضان 37 درجة مئوية لمدة ساعة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ساعة واحدة إزالة مزيج النفق ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الماضي ، إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميليلتر من تخفيف 1 / 1000 من الأجسام المضادة Calbindin في برنامج تلفزيوني واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل إزالة الأجسام المضادة الأولية ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المخفف 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية 1 / 500 في برنامج تلفزيوني واحتضان ما لا يقل عن ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة في الظلام. هو المسمى عدة النفق كنا مع أحمر TMR ، وبالتالي لدينا جسم الثانوية لغير مترافق Calbindin إلى اليكسا - 488. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع برنامج تلفزيوني وتحميل الشرائح على شريحة ميكروسكوب زجاجية باستخدام وسائل الإعلام المتصاعدة التي تحتوي دابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة مع شرائح المجهر مبائر باستخدام 488 نانومتر و 561 نانومتر wavelenght الإثارة لCalbindin والنفق على التوالي. </li></ol></li></ol> 3. ممثل النتائج : التحدي الرئيسي لهذا البروتوكول هو أن تكون قادرة على توليد صحية الثقافات شريحة المخيخ ، وخصوصا قراءات هدفنا النهائي سيكون موت الخلية. ثقافة صحية كما يبدو واحد حيث طبقة شفافة من خلايا الجسم ، ويسمح لك أن ترى هيكل ورقي من المخيخ تحت المجهر (الشكل 1). ويمكن ملاحظة بعد أيام قليلة في الثقافة شرائح رقيقة تبدأ الخلايا العصبية ، وغير المهاجرة بعيدا عن هامش شريحة. والخلايا الجولة الظلام (الضامة الأرجح) التي تغطي شرائح بعد أيام قليلة في الثقافة ، وانخفاض في نهاية المطاف في عدد بعد 10-14 يوما في المختبر (الشكل 2) 5. والدليل القاطع لبقاء شرائح هو وصمة عار للعلامات الخلوية المختلفة ، مثل Calbindin للخلايا بركينيي. ويبين الشكل 3 ممثل صورة المجهر مبائر طبقة بركينيي بنواة خلية النفق عدة إيجابية. من المهم أن نرى أن بعض الشرائح حتى لو حصل على التحفيز أفكارك ، إلا أنهم تعرضوا لمدة 24 ساعة. هذا يسمح الوقت الكافي لمراقبة تجزئة الحمض النووي في الخلايا الميتة مع تلوين النفق ، ولكن خلية بركينيي طبقة محددة لا تزال موجودة. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. شريحة مخيخي DIV2 صحية في هذه الصورة تظهر خلايا الجسم طبقة شفافة وهيكل ورقي للدماغ في شريحة صحية. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. مخيخي شريحة صحية في DIV 7. وفي هذه الصورة يمكننا أن نلاحظ ما زال هيكل ورقي من المخيخ وظهور هيئات زنزانة مظلمة. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. صورة ممثل شريحة المعالجة مخيخي فاس ، وهذا يدل على صورة مبائر خلايا بركينيي ملطخة Calbindin (الخضراء) والخلايا أفكارك إيجابية لتلطيخ النفق (الحمراء). خلايا بركينيي لا تظهر في صف واحد ولكن تتجمع تشكيل هيكل folium الشبيهة.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

وقد تم عمل جميع الحيوانات التي أجريت وفقا للسياسات التي وضعتها IACUC. معهد سالك هو مرفق AAALAC المعتمدين.

يصف هذا الأسلوب واحد من التطبيقات الممكنة العديد من الثقافات عضوي النمط العصبية وانه سمح لنا لدراسة تأثير المنبهات أفكارك في نوع البرية وشرائح مخيخي متحولة. أهم جزء من هذه التجربة هو أن تكون قادرة على توليد باستمرار صحية الثقافات شريحة مخيخي. العوامل الرئيسية هي تشريح وتقطيع والتقنية والقدرة على تنفيذ البروتوكول في أقل وقت ممكن ، ولكن في نفس الوقت الحرص على عدم الاضرار الشرائح. عامل آخر بالغ الأهمية يتمثل في إعداد وتكوين وسائل الإعلام والثقافة ، وهذه الثقافات هي حساسة للغاية ، لذلك اضطررنا لاختبار عدة وصفات والعلامات التجارية من وسائل الإعلام. حتى يمكن دفعات مختلفة من المصل أو أي مكونات أخرى من وسائل الاعلام تؤثر على صلاحية الشرائح. حصلنا على أفضل النتائج مع المصل من الخيل لوط Invitrogen # 480116. حالما يتم إنشاء شرائح مخيخي يمكن للمرء أن دراسة تطوير مخيخي ، الكهربية ، وبقاء الخلية وحدها أو استجابة لمنبهات أفكارك ، أو الحرمان excitotoxicity الأوكسجين. وقد تم إجراء دراسات مقارنة باستخدام نوع البرية وشرائح مخيخي متحولة الثاقبة للغاية في كثير من جوانب وظيفة المخيخ والتنمية.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>مصل الخيل</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>جلوتامين</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>بنسلين/ ستريبتومايسين</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>غراء فائق (Superglue)</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>أطباق زراعة خلايا 6 آبار / 24 بئرًا</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>أدراج أطباق زراعة 30 مم (مسام 0.4-&amp;mu;m)</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>جسم مضاد من الهامستر anti-mouse CD95 (Jo2) منقى NA/LE</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>طقم الكشف عن موت الخلايا &lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt;، TMR red</td><td>Roche Group</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>جسم مضاد من الأرنب anti-Calbindin D-28k</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>جسم مضاد ثانوي Alexa 488-goat anti-rabbit IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>وسط تثبيت Vectashield مع DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>مجهر تشريح</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>جهاز قطع الأنسجة الاهتزازي (Vibratome)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مجهر بؤري (Confocal Microscope)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

مخيخي الثقافات عضوي النمط : التحديات والكشف عن أفكارك

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

وقدم لأول مرة الثقافات عضوي النمط من الأنسجة العصبية التي هوغ 1،2 في عام 1947 وشكلت اختراقا كبيرا في مجال علم الأعصاب. منذ ذلك الحين ، تم تطوير تقنية أخرى ، وحاليا هناك العديد من الطرق المختلفة لإعداد عضوي النمط الثقافات. قدم هنا كان الأسلوب مقتبس من واحد التي وصفها Stoppini آخرون لإعداد الشرائح وآخرون من Gogolla. الإجراء تلطيخ 3،4. ومن المزايا الفريدة لهذا الأسلوب هو أنه يتيح لك لدراسة أجزاء مختلفة من الدماغ مثل الحصين أو المخيخ في هيكلها الأصلي ، مما يوفر ميزة كبيرة على الثقافات التي نأت تتعطل كل شبكات الخلوي وتنظيم الخلايا العصبية. في حالة من المخيخ هو أكثر فائدة لأنها تتيح دراسة خلايا بركينيي ، من الصعب للغاية الحصول على والثقافة الأولية فصلها. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة ميزات تنموية معينة من المخيخ في المختبر ، فضلا عن التجارب الدوائية والكهربية في كل نوع البرية وفئرانا معدلة وراثيا. وصف الأسلوب هنا تم تصميمه لدراسة تأثير المنبهات مثل أفكارك يجند فاس في المخيخ النامية ، وذلك باستخدام تلوين النفق لقياس أفكارك موت الخلية. إذا تم الجمع بين النفق تلطيخ مع نوع من الخلايا علامات محددة ، مثل Calbindin للخلايا بركينيي ، فمن الممكن لتقييم موت الخلايا في خلية بطريقة معينة من السكان. لتلطيخ Calbindin يخدم أيضا غرض تقييم نوعية الثقافات مخيخي.

هذا الأسلوب يصف جيل من الثقافات مخيخي عضوي النمط وتأثير المحفزات أفكارك معينة على جدوى مختلف أنواع الخلايا مخيخي.

قُدمت المزارع النسيجية العضوية للأنسجة العصبية لأول مرة بواسطة Hogue في عام 1947 1,2، وقد شكلت طفرة كبرى في مجال العلوم العصبية. ...

الهدف العام من التجربة التالية هو استقصاء تأثير المحفز الاستماتي fast ligand في المخيخ النامي للفئران البرية والفئران الطافرة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح دماغ الفئران البرية والفئران المطرقة في الفترة ما بين اليومين الثامن والثاني عشر بعد الولادة. وتتمثل الخطوة الثانية في تقطيع الدماغ إلى شرائح بسمك 400 ميكرومتر وعزل المخيخ من كل شريحة.تتمثل الخطوة الثالثة في استزراع شرائح المخيخ لمدة خمسة أيام للتأكد من سلامتها قبل تحفيز موت الخلايا باستخدام fast ligand. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تحليل تأثير fast ligand في المجموعات الخلوية المختلفة للمخيخ في الفئران من النوع البري (wild type) والفئران المعدلة وراثياً (knockout)، وذلك بناءً على التلوين المناعي الفلوري لعلامة التلاشي الخلوي tunnel، مقترناً بعلامات محددة لأنواع الخلايا مثل calbindin لخلايا bikini. وتكمن الميزة الرئيسية للمزارع الحية للمخيخ في أنها تسمح بالحفاظ على البنية الإقليمية للمخيخ، على عكس المزارع الأولية المفككة حيث تتعرض الشبكات العصبية والتنظيمات الخلوية للتلف.لذا، ستسمح هذه المسألة بالإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في العلوم العصبية، خاصة بوجود الفأر من النوع البري والفأر الطافر. وبذلك يمكن دراسة التطور المقارن، ودراسة الفسيولوجيا، وكذلك الفسيولوجيا الكهربائية وعلم الأدوية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول وظيفة fast ligand في بقاء خلايا المخيخ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لدراسة تأثيرات fast ligand في القشرة المخية والحصين.بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة، لأنه من أجل الحصول على تحلل سليم للمخيخ، من الضروري وضع العينات في المزرعة بأسرع ما يمكن دون المساس بسلامتها. لذا، من المهم امتلاك مهارات جيدة في التشريح والتقطيع قبل محاولة تنفيذ العملية بأكملها، كلما أمكن ذلك.يجب تنفيذ خطوات الإجراء التالي داخل غطاء زراعة الأنسجة قبل البدء في عملية التشريح. قم بتحضير وسط A CSF لتشريح الدماغ وتجهيز الشرائح، بالإضافة إلى وسط زراعة الشرائح وفقاً للبروتوكول المكتوب، واحفظهم عند درجة حرارة 4 °C في يوم التشريح. جهز أطباق زراعة الأنسجة لزراعة شرائح المخيخ.أضف 1 mL من وسط استنبات الشرائح إلى كل بئر في طبق مكون من ست آبار. ثم استخدم ملقطاً معقماً لوضع إدراجات طبق الاستنبات في كل بئر، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء محبوسة أسفل الإدراج.ضع طبق الزرع في حاضنة زراعة الأنسجة المضبوطة عند 37 درجة Celsius و5% ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين على الأقل لتهيئة الوسط. بعد ذلك، قم بفقاعة وسط CSF المبرد بالثلج باستخدام غاز الكاربوغين؛ حيث يؤدي تشبع الوسط بغاز الكاربوغين إلى تغيير pH المحلول، مما ينتج عنه تغير في اللون من الأحمر إلى البرتقالي.صُب كمية قليلة من وسط A CSF المبرد والمُفقّع في طبق بتري معقم ولوحة ذات ستة آبار. ضع هذه الأوعية على الثلج مع لوحة جهاز vibrato الذي سيُستخدم لتقطيع الدماغ. سيُستخدم طبق بتري الذي يحتوي على وسط A CSF المبرد والمُفقّع لتشريح الدماغ من جرو فأر في المرحلة العمرية من P8 إلى P12 بعد عملية التشريح.استخدم شفرة حلاقة لإجراء قطع سهمي في أحد نصفي الكرة المخية لتوفير سطح مستوٍ للتثبيت على لوحة الاهتزاز (vibram plate). يمكن أيضاً قطع الجزء المنقاري من القشرة المخية. جفف لوحة الاهتزاز المبردة باستخدام منشفة ورقية.بعد ذلك، ضع كمية قليلة من الغراء السريع (super glue) على المنصة ووزعها بشكل متعرج باستخدام طرف أنبوب الغراء. ولتكوين طبقة لاصقة رقيقة، استخدم ملعقة مسطحة (spatula) لنقل الدماغ إلى منصة جهاز الـ vibratome بحيث يكون الجانب المسطح ملامساً للغراء السريع. وبمجرد تثبيت الدماغ على صفيحة الـ vibram، أضف كمية كافية من وسط A CSF لتغطية الدماغ، وضع الثلج أسفل الصفيحة للحفاظ على برودته.قطّع الدماغ إلى شرائح بسمك 400 ميكرومتر. ثم استخدم ماصة بلاستيكية ذات طرف مقطوع ومتسع لنقل الشرائح إلى طبق سداسي الفجوات يحتوي على وسط A CSF على الثلج، وذلك أثناء العمل تحت المجهر التشريحي.استخدم حقنتين من حقن الإنسولين بإبر صغيرة القطر مقاس 28 gauge لفصل المخيخ عن بقية الدماغ. إذا كانت أي من الشرائح تحتوي على غراء سريع (super glue) على الحافة، فاستخدم إبر الحقنتين لإزالة الغراء من الشريحة. استخدم ماصة بلاستيكية (pasta pipette) ذات طرف مقصوص وموسع لنقل الشرائح إلى أعلى المرشحات.تضمن إضافة شريحة واحدة إلى ثلاث شرائح لكل قطعة إدراج أن تكون الشرائح ممتدة بالكامل وألا يغطيها أي سائل. إذا لزم الأمر، يتم سحب الوسط الزائد باستخدام الماصة، وتُحضن العينات في درجة حرارة 37 degrees Celsius و 5%carbon dioxide لمدة 48 ساعة. بعد مرور 48 ساعة، يتم استبدال نصف حجم الوسط بوسط جديد، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء محبوسة أسفل قطعة الإدراج.يحتوي الوسط الأصلي المتبقي على عوامل تغذية مشتقة ومقطعة ضرورية لبقاء الخلايا. يتم إجراء تحدي الموت الخلوي المبرمج بعد خمسة أيام من الزرع. أضف الجسم المضاد التنافسي السريع JO two إلى أوساط الزرع الخلوية في الآبار المراد معالجتها.اترك نصف الآبار دون معالجة لتكون بمثابة ضوابط. بعد مرور 24 ساعة، اسحب الوسط من أسفل الآبار. ثم قم بتثبيت الشرائح عن طريق إضافة ملليلتر واحد من البارالدهيد بنسبة 4% مبرد إلى درجة الصفر المئوية تحت الإدراج، وملليلتر واحد من PFA فوق الإدراج.اترك الشرائح لتتثبت في الـ PFA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد مرور 10 دقائق. اشفط الـ PFA واغسلها لفترة وجيزة باستخدام مليليترين من الـ PBS البارد عن طريق السحب والضخ بالماصة، بحيث يتم وضع مليليتر واحد فوق الإدراج ومليليتر واحد تحت الإدراج.بعد ذلك، يتم شفط PBS وإضافة ملليلتر واحد من الميثانول بتركيز 20% المبرد بالثلج في PBS أسفل الغرسة وملليلتر واحد فوق الغرسة. تُحضن العينة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم يُشفط الميثانول بتركيز 20% من البئر وتُغسل الشريحة والبئر D باستخدام PBS. وكما سبق، يتم إضافة ملليلتر واحد من Triton X 100 بتركيز 0.5% في PBS فوق الغرسة، وملليلتر واحد آخر أسفل الغرسة.يتم التحضين لمدة لا تقل عن 12 ساعة عند درجة حرارة 4 °C لنفاذية الشرائح بعد عملية النفاذ. يتم شفط 0.5% Triton X 100 في PBS، ثم تُنقل بواسطة الماصة كمية 1 mL من 20% BSA في PBS فوق الشريحة و 1 mL تحت الشريحة. تُحجب الشرائح لمدة لا تقل عن أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.عند اكتمال عملية الحجب، استخدم مقصاً نظيفاً لقص قطعة غشاء الإدخال المتصلة بشريحة المخيخ بعناية. ثم استخدم ملقطاً نظيفاً لنقل قطعة الغشاء إلى طبق يحتوي على 24 بئراً به PBS، ثم اسحب الـ PBS وأضف 250 µL من كاشف tunnel إلى كل بئر، مع التأكد من أن الكاشف يغطي سطح الشريحة بالكامل.يُحضن العينة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في الظلام، وعند انقضاء الساعة، يتم سحب كاشف النفق من الآبار واستبداله بـ 500 microliters من PBS. تُحمى اللوحة من الضوء وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للغسل.كرر هذه العملية مرتين بعد عملية الغسل الأخيرة. اشفط محلول PBS وأضف 250 µL من مضاد الكالبيندبن (calbindin antibody) بتخفيف 1:1000 في محلول PBS، ثم قم بالتحضين طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في الظلام. وفي اليوم التالي.قم بسحب محلول الجسم المضاد الأولي واغسل باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أضف 250 µL من الجسم المضاد الثانوي المخفف بنسبة 1 إلى 500 في PBS. غطِّ الطبق بورق ألومنيوم لحمايته من الضوء، ثم قم بالتحضين لمدة ثلاث ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة بعد عملية التحضين.اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة 10 دقائق باستخدام PBS، واستخدم وسط تثبيت يحتوي على dappy. قم بتثبيت الشرائح على شريحة مجهر زجاجية وغطاء شريحة. قم بتصوير الشرائح باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope) باستخدام أطوال موجات الاستثارة 488 نانومتر و 561 نانومتر لـ kale و bendin و tunnel على التوالي.تظهر هذه الصورة شريحة مخيخ سليمة. بعد يومين من الزرع المختبري (in vitro)، تبدو طبقة أجسام الخلايا شفافة، ويظهر التركيب الورقي للمخيخ بوضوح تحت المجهر. وبعد سبعة أيام من الزرع المختبري، لا يزال التركيب الورقي لشريحة المخيخ السليمة مرئياً.بالإضافة إلى ذلك، عادةً ما تغطي الشريحة أجسام خلوية داكنة، يُرجح أنها خلايا بلعمية. وتعتبر الصورة المجهرية بؤرية المسافة (confocal) المعروضة هنا ممثلة لشريحة من المخيخ عولجت بسرعة. تظهر خلايا بيكيني باللون الأخضر بعد الصبغ باستخدام جسم مضاد أولي، يليه جسم مضاد ثانوي مقترن بـ Alexa 488.تظهر الخلايا المبرمج موتها والتي تكون إيجابية لصبغة tunnel باللون الأحمر لأن مجموعة tunnel المستخدمة مُوسومة بـ TMR. لا تظهر خلايا Bikini الحمراء في صف واحد، بل تظهر في تجمعات تشكل بنية شبيهة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر العمل داخل غطاء زراعة الأنسجة كلما أمكن ذلك، وتقليل amount الوقت الذي تتعرض فيه أنسجة المخ للملوثات المحتملة مثل البكتيريا أو الفطريات.باستخدام هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى على هذه الشرائح، بما في ذلك التحاليل الكيميوحيوية والفيزيولوجيا الكهربائية لتوفير معلومات إضافية عن محتوى البروتين وكذلك استثارة الخلايا العصبية. طُورت هذه التقنية في الأصل لدراسة تأثير الموت الخلوي السريع في خلايا Perkin التي تحمل طفرات تؤثر على المسار السريع. ونادراً ما تنجو خلايا Perial في المزارع الأولية.لقد كان هذا الإجراء هو النهج التجريبي الأمثل. لذا آمل أنه بعد مشاهدة هذا الفيديو، ستتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تحضير شرائح المخيخ وكيفية دراسة المحفزات اللاهوائية وتأثيرها على أنواع الخلايا المخيخية المختلفة.

organotypic-cerebellar-cultures-apoptotic-challenges-and-detection

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

تعيش خلية من الخلايا بوساطة التصوير كاسباس 3 في خلد الثقافات الخلية N19 - oligodendrocyte...

رصد المشقوق كاسباس 3 النشاط وموت الخلايا المبرمج للخلايا Oligodendroglial مخلد باستخدام خلايا حية التصوير وCleaveable ركائز Fluorogenic صباغة وبعد زوال الاستقطاب الناجم عن غشاء البوتاسيوم

نقدم البروتوكول الذي يسمح لعرض وتقويم كمي والتشكل من شجرة شجيري الخلايا العصبية الفردية التي تزرع في عضوي النمط الثقافات شريحة المخيخ. ويهدف هذا البروتوكول إلى تعزيز الدراسات حول آليات الخلية العصبية تنمية شجيري.

على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط

يوضح هذا الفيديو تقنية للحصول على شرائح عضوية مخيخية من دماغ جرو الفأر وزراعة الشرائح في وسائط مكملة بالعناصر الغذائية وعوامل النمو لتقليد نمو المخيخ في المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعامل مع شرائح مخيخية معينة بمركب اختبار ، ويتم تحليل قدرة الحماية العصبية للمركب باستخدام تقنية تلطيخ التألق المناعي.

تحليل بقاء خلايا بركنجي في مزارع شرائح المخيخ العضوية

يوضح هذا الفيديو طريقة تحديد الخلايا العصبية من مزرعة مختلطة من الخلايا العصبية الحبيبية المخيخية والخلايا الدبقية باستخدام تلطيخ مزدوج مع ثنائي أسيتات الفلوريسين (FDA) ويوديد البروبيديوم (PI) ، حيث تظهر الخلايا العصبية الحية باللون الأخضر وتظهر الخلايا العصبية الميتة باللون الأحمر.

تقييم صلاحية الخلايا العصبية في ثقافة الخلايا العصبية المخيخية عن طريق التلوين المزدوج

الطبقة الحبيبية الخارجية للدماغ هي موقع أكبر التضخيم العابر في الدماغ النامية. هنا، نقدم بروتوكول لاستهداف التعديل الوراثي لهذه الطبقة في ذروة انتشار استخدام خارج الجسم الحي Electroporation للوثقافة شرائح للدماغ من الجنينية يوم 14 افراخ الدجاج.

فيفو السابقين الثقافة من الفرخ مخيخي شرائح المستهدفة ومكانيا Electroporation للمن الحبيبة السلائف الخلية

يصف هذا البروتوكول كيفية قياس بدقة بقاء الخلايا العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات (فدا) والبروبيديوم يوديد (بي) تلطيخ مزدوج في الخلايا العصبية الحبيبية المخيخ مثقف، ثقافة العصبية الأولية المستخدمة كنموذج في المختبر في علم الأعصاب والبحوث العصبية.

تقييم الجدوى العصبية باستخدام فلوريسئين دياسيتات-بروبيديوم يوديد تلطيخ مزدوج في المخيخ الحبيبية الثقافة العصبية

ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل واستزراع الماوس الأساسي الحبيبية الدماغي الخلايا العصبية (كنس) من يوم 6-7 القديمة الجراء، كفاءة توصيل لكنس للخسارة والحصول على دراسات مهمة، ونمذجة excitotoxicity الخلايا العصبية التي يسببها نمدا، موت الخلايا التي يسببها البوتاسيوم منخفضة وتلف الحمض النووي، والأكسدة باستخدام نفس نموذج الثقافة.

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

هنا نقدم طريقة لإعداد أورجانوتيبيك الثقافات شريحة من المخيخ الماوس وغمد المايلين تلطيخ من إيمونوهيستوتشيميستري مناسبة للتحقيق في آليات مييلينيشن وريميلينيشن في الجهاز العصبي المركزي.

إعداد و Immunostaining أورجانوتيبيك ميليناتينج شريحة الدماغ الثقافات

اجراء التجارب في المختبر للتفكير في الظروف المجرية باقصي قدر ممكن ليست مهمة سهله. استخدام ثقافات الخلايا الاوليه هو خطوه هامه نحو فهم بيولوجيا الخلية في كائن حي بأكمله. البروتوكول المنصوص عليه الخطوط العريضة كيفيه النمو بنجاح وثقافة الخلايا العصبية المخيخ الفئران الجنينية.

الثقافة الاساسيه للخلايا العصبية معزولة عن المخيخ الفئران الجنينية

الثقافات شريحة التنميط العضوي هي أداه قويه لدراسة العمليات العصبية أو التنكسية/التجدد. هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي نماذج وفاه النمو العصبي للخلايا Purkinje في الثقافات شريحة الفئران المخيخ. هذا الأسلوب قد تستفيد البحوث في اكتشاف المخدرات نيوروبروتكتيف.

البقاء علي قيد الحياة خليه purkinje في الثقافات شريحة المخيخ الوراثية

خلايا بركنجي المخيخية (PCs) حساسة بشكل خاص لأوجه القصور في استجابة تلف الحمض النووي. يتم تقديم بروتوكول للتقييم البصري لديناميكيات استجابة الكمبيوتر الشخصي لتلف الحمض النووي ، والذي يتضمن تلطيخ سلاسل البولي (ADP-ribose) المرتبطة بالبروتين داخل الثقافات العضوية المخيخية.

تصور استجابة تلف الحمض النووي في خلايا بركنجي باستخدام الثقافات العضوية المخيخية

اكتشف طريقة إعداد مزارع مخيخية نمطية عضوية لدراسة تأثير المحفز المستحث للموت الخلوي على خلايا المخيخ في الفئران البرية والمتحولة. تساعد هذه التقنية الباحثين على فهم آليات البقاء الخلوي.

مخيخي الثقافات عضوي النمط : التحديات والكشف عن أفكارك

استكشف المزيد من الفيديوهات