Name: المهاجرة سلوك الخلايا المولدة في الثقافات سماحة العقدية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: اكتشف سلوك الهجرة الخلوية في علم الأعصاب التنموي باستخدام تقنية التصوير الزمني للثقافات ثلاثية الأبعاد. تتيح هذه الطريقة مراقبة حركات الخلايا الفردية وتحليل استجاباتها الكيميائية الحركية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل وزارة الدفاع غرانت PT074620 (SLJ) وغرانت NIH R01NS245014 (SLJ).

1. كاشف إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد المجمدة Matrigel على الرطب ، وترك ما يكفي من الوقت قبل التجربة (لا تسرع العملية عن طريق الانحباس الحراري النشط). Matrigel يستخدم لإنشاء بيئة 3D تشبه عن كثب مصفوفة خارج الخلية المؤدية إلى الهجرة من الخلايا. أنها توفر الخلايا مع كل ركيزة والميكانيكية التغليف. يتم تخزين Matrigel المجمدة في -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام ، يجب أن تكون عليه تدريجا حتى درجة حرارة 0-4 درجة مئوية ، أي إذابة الجليد على الرطب أو في الثلاجة. Matrigel مجموعات لا رجعة فيه لتشكيل هلام في درجة حرارة الحضانة (37 درجة مئوية). لذا فمن غير المستحسن لتسريع ذوبان بغمر الحاويات في المياه الدافئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعد كسور البروتين من خلال التركيز كهرساوي (IEF) من استخراج البروتين الكلي من قشرة الدماغ من 0 يوم بعد الولادة (P0) النمس. بعد الانفصال ، ومدال الكسور بين عشية وضحاها ضد pH7.2 تريس ، حمض الهيدروكلوريك 20mM لتنظيف مقتطفات من مكونات عازلة التركيز ، والتي قد تكون سامة للأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكثف البروتين نظام التسليم. البروتينات المستخرجة من قشرة الدماغ على حبات الفلورسنت التي اللاتكس ثم حرر ببطء إلى environment.We البروتينات وجدت أن ميزة مضان يساعد في معالجة البصرية المجهرية ويسمح الكشف عن الآثار غير المباشرة من السهل حتى الحد الأدنى من موقع حبة وديعة ، وعندما لاحظ تحت المجهر الفلورسنت. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10μl من الخرز الفلورسنت ل200μl - 100 من محلول البروتين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحتضان 30min في الظلام في RT على شاكر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخرز عليها في جهاز للطرد المركزي لمقاعد البدلاء 1hr بسرعة قصوى </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في دوامة باستخدام 10μl متوسطة جديدة ، إعادة تعليق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30μl من Matrigel إلى تعليق ، ومزيج جيد ، ومكان على الجليد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخازن ووسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد والترشيح تعقيم - الاصطناعي السائل النخاعي (aCSF ؛ 124mM كلوريد الصوديوم ، NaHCO 26mM 3 ، 2 ص 4 ناه 1.2mM ، بوكل 3.2mM ، MgSO 4 1.2mM ، CaCl 2 2.4mM ، 10MM الجلوكوز). تبذير للتجمد في aCSF مسبقا ، بحيث يكون جاهزا في وقت تشريح الأنسجة. لجعله ، ضع قارورة بلاستيكية مملوءة aCSF العقيمة في الفريزر -80 درجة مئوية. رصد تجميد كل ذلك في كثير من الأحيان ، وذلك عندما طبقة من الجليد يتراكم في داخل الجدار ، وانكساره والاختلاط مع السائل. كرر حتى قارورة تحتوي معظمها طين الجليدية. أعد العازلة بهذه الطريقة ليس فقط تؤيد بقاء الأنسجة ، ولكن سوف يعقد أيضا درجة حرارة منخفضة لفترة أطول ، وميكانيكيا أقل ضررا للأنسجة من مكعبات الثلج مكتنزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة Neurobasal مع N - 2 و B - 27. الملاحق المضافة وفقا لاقتراحات الشركة المصنعة ، فضلا عن 1mg/100ml الجنتاميسين ، 2 مم L - الجلوتامين ، والجلوكوز بنسبة 0.6 ٪ تعقيم عن طريق الترشيح من خلال غشاء 0.22μm. الدفء عند 37 درجة مئوية حتى استخدام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة لوحات <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعد ثقافة الصف البلاستيكية ستة جيدا لوحات بواسطة تنقيط كل بئر في وسطها مع كمية صغيرة (حوالي 2μl) من Matrigel الباردة باستخدام 20μl ماصة الحافة ، وتعقيمها مما يشكل الجولة ساترة 18mm الزجاج في كل قطرة. لا لوحات ولا coverslips على ضرورة أن يكون خلاف ذلك ثقافة المعالجة. </li></ol></li></ol> 2. تحضير الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على أنسجة المخ <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التخدير العميق مع Euthasol الحيوان ، وإزالة المخ وضعه في الثلج الباردة aCSF </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل نصفي الكرة مع مشرط وشريحة coronally في 500μm باستخدام جهاز للاختيار ، وجمع شرائح في صحن صغير يحتوي على الجليد الباردة aCSF </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل explants (استخدام مجهر تشريح) <ol class="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الشرائح التي تحتوي على الفضيلة العقدية (GE) والمناطق تقليم من القشرة التي قد تلتف على شركة جنرال الكتريك ، وتتداخل مع اتخاذ مزيد من الخطوات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على هاريس أحادي النواة يحمل في منطقة قريبة من سطح البطين من جنرال الكتريك ، والتراجع عن نواة تحتوي في الغالب منطقة البطين ، وإخراجها مع المكبس في المتوسط ​​الجليد الباردة (Fig.1). explants ثلاثة إلى أربعة من 0.5 ويمكن إجراء قطرها ملم من شركة جنرال الكتريك في احد P0 النمس شريحة الدماغ. يرجى ملاحظة أنه في كلتا القوارض وقوارض ، وتنصهر في GES الإنسي والجانبية في هذه المرحلة العمرية. إذا كان جوهر يبقى في شريحة أو عالق إلى أسفل البلاستيكية للطبق ، وحشد من قبل التدفق aCSF مع طرف ماصة ونقل مع ماصة في صحن يحتوي المتوسطة Neurobasal الباردة. الحفاظ على طبق على الجليد الرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل دفعة من explants من المتوسط ​​إلى انخفاض عدد كبير من الجليد الباردة Matrigel (حوالي 0.25 - 0.5ml) وضعت في طبق منفصل ، مع الحرص على أن يكون explants مغمورة تماما وتجنب الفقاعات. الحفاظ على طبق على الجليد الرطب. حجم دفعة يعتمد على سرعة مجرى سير العمل. </li></ol></li></ol> 3. الإعداد الثقافة (استخدام مجهر تشريح) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دائما Matrigel وMatrigel المحتوية على الجليد يمزج لتجنب المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريمكس تعليق حبة ومكان 1 - 2μl أو أقل من تعليق خرزة في الجليد الباردة Matrigel في وسط الزجاج توضع ساترة سابقا في لوحة الثقافة جيدا باستخدام تلميح 20μl ماصة. ندعه مجموعة قليلا ، وتجنب الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلميح باستخدام ماصة 20μl التقاط explants 2 من القائمة المنسدلة Matrigel ووضعها في محيط المرجوة من ودائع حبة (على الأقل 1MM بعيدا عن حافة إيداع) بشكل متناظر على طرفي نقيض. السماح لها مجموعة لمدة لا تزيد 5min في درجة حرارة الغرفة ، والتوقيت المناسب من الخطوات ب و ج أمر بالغ الأهمية. إذا كان الوقت قصيرا جدا وسوف يؤدي ذلك إلى عدم اكتمال التبلور ومكونات الثقافة الإعداد سوف تتحرك عندما يتم تغطيتها بطبقة من Matrigel النهائي ، وإذا كان وقت طويل جدا قد يؤدي إلى جفاف أكثر من الجل وخلق الحواجز المادية التي تعيق حرية تنقل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية والخرز ويزدرع مع طبقة مسطحة من حوالي 30μl من Matrigel ، امتداده خارج explants (Fig.2). ندعه المنصوص عليها في الحاضنة لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2ml المتوسطة Neurobasal مع ملاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ O 2 / 95 ٪ رصد النشاط 2 المهاجرة يوميا. </li></ol> 4. يعيش التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة لمدة 3-4 أيام ، واستعراض لوحات والثقافة ، واختيار coverslips المصالح. يجب أن تولد explants سحابة موحدة شعاعيا من الخلايا. استبدال coverslips المختار في لوحة الثقافة الجديدة التي سيتم استخدامها في تصوير حي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للcoverslips الجلوس في لوحة جديدة خلال الليل. قبل ان يضع لوحة على المجهر للتصوير ، في خلية ثقافة هود ، واستخدام ملعقة لتحريك العقيمة ساترة من أجل الإفراج عن أي microbubbles التي تجمع بين لوحة ساترة والثقافة الخلية. وسوف تدخل فقاعات الخراب الصور. نقل coverslips إلى وسط البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع التبخر ، وملء الفراغ بين الآبار بالماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية لوحة من الخلية هود الثقافة المجهر حتى لا تحرك coverslips من وسط البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعريف نظام التصوير باستخدام برامج التصوير ، ونظرا لطبيعة 3D الإعداد للثقافة أيضا نقل الخلايا عموديا ، وبالتالي فإنه من المهم جمع Z - الطائرات يشمل العمق الكامل للسحابة الهجرة. وينبغي أيضا مدى XY للمنطقة أن التقط مجموعة كبيرة بما يكفي لتغطية المناطق التي يتوقع أن يتم ملؤها من قبل الخلايا المهاجرة أثناء التسجيل ، ويحتوي على ودائع حبة من أجل تسجيل التوجه الزاوي لازدراع والخلايا المهاجرة مقارنة مصدر للبروتين. تنظر أيضا أنه كلما تصوير طائرات Z ، أو أكثر من المساحة التي تغطيها ، والمزيد من الوقت الذي يستغرقه لتسجيل حلقة في نقطة زمنية معينة ، مما اضطر فترات زمنية أطول بين العينات وفقدان القرار الزماني لتعقب الخلية. في حالتنا ، وذلك باستخدام الهدف 10X ، كان المخطط الأمثل لتسجيل بلاط 3X3 لكل من Z - 10 طائرات متباعدة كل 20μm ، على فترات 30min. وجدنا فترات أطول 30 دقيقة تسمح بتحديد لا لبس فيه من الخلايا في وقت نقاط متتالية ، وهو أمر حاسم لتتبع تحركاتهم موثوق بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تصوير مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الوقت المطلوب ، وإزالة لوحة والإصلاح الثقافات في 4 ٪ الفوسفات مخزنة بارافورمالدهيد. يمكن استخدامه لمزيد من التحليل الصرفي وimmunocytochemical. </li></ol> 5. تحليل الحركة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل سلاسل زمنية من الصور المسجلة في شكل أكثر ملاءمة لمزيد من المعالجة ، TIFF ، كونها الأكثر المحمولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبع حركة الخلايا الفردية على مر الزمن من خلال تسجيل إحداثيات XY ، ويمكن القيام بذلك باستخدام البرمجيات المتاحة بحرية مثل ImageJ (NIH) مع تتبع المختصر في المكونات ، أو أي تطبيق تجارية أخرى مثل ImagePro ، أو Volicity AutoQuant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم المسارات باستخدام Excel أو في منزل البرمجيات المتقدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل خلية تتبع حساب المعلمات الحركية مثل متوسط ​​السرعة ، انحناء المسار ، وتقلب الاتجاه مع مرور الوقت ، المتفرعة ، والانحراف في اتجاه مصدر للبروتينات ، ويمكن القيام به وما الحسابات في MS Excel أو أي جدول ما يعادلها. لكن خبرتنا تشير أنه أبعد ما يكون أكثر إنتاجية لتطوير البرامج النصية في المنزل (باستخدام R ، ماتلاب ، بيثون ، بيرل أو غيرها ، لغات المصدر المفتوح في الغالب) ، كما أنها تسمح للتخصيص أكثر مرونة وإدراج الطرق التحليلية أكثر تطورا من تلك التي تتوفر في تثبيت الأساسية من Excel. </li></ol> 6. ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. رسم تخطيطي للأوريجي التشريحيةن من explants. هذا هو رسم لشريحة من الدماغ الاكليلية النمس hemisected. الدوائر الرمادية تشير إلى المنطقة التي اتخذت explants. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. رسم توضيحي لإعداد الثقافة. إيداع حبة هو مصدر للبروتينات ، ويتم وضع explants إلى جانبي ، وتتم تغطية جميع العناصر مع Matrigel. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. المناظرة قطع المسارات الخلية الملونة التي الأرباع (السهام نحو نقطة إيداع حبة). المسارات الخلية على اليمين وتهاجر نحو مد الكسر ، والذي يظهر على جذب الخلايا ، والخلايا على اليسار وتهاجر نحو ألف جزء ، والذي يظهر في مقاومة الخلايا المهاجرة. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="الشكل 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 4"> الشكل 4. أ) مجموعة من الصور المختارة من timepoints تظهر سحابة متزايدة من الخلايا المهاجرة من أصل ازدراع. يتم تعقب خلية سبيل المثال ، أشار إليه أحد الأسهم ، مع مرور الوقت كما هو مبين أدناه (شريط مقياس 200μm). وتصور هذه يزدرع مع التصوير لمدة 38 ساعة العيش الصور المعروضة هنا هي من الخلايا ترك يزدرع من بداية تسجيل الصور إلى الصورة النهائية. B) الخلية المشار إليها في الجزء ألف في الأوقات المحددة. الخلية يظهر المتفرعة المتكررة (مقياس شريط 50μm).

<ol><li>Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cortical+development%3A+a+view+from+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice.</a> Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).</li>
<li>Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+preoptic+area+is+a+novel+source+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons.</a> J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).</li>
<li>Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radialization+factor+in+normal+cortical+plate+restores+disorganized+radial+glia+and+disrupted+migration+in+a+model+of+cortical+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).</li>
<li>Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., Götz, M., Offermanns, S., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+deletion+mutants+reveal+a+role+for+semaphorin+receptors+of+the+plexin-B+family+in+mechanisms+underlying+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis.</a> Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riding+the+glial+monorail%3A+a+common+mechanism+for+glial-guided+neuronal+migration+in+different+regions+of+the+developing+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain.</a> Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Central nervous system neuronal migration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).</li>
<li>Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lhx6+activity+is+required+for+the+normal+migration+and+specification+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).</li>
<li>Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+pattern+of+tangential+neuronal+migration+during+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development.</a> Development. 134, 2815-2827 (2007).</li>
<li>Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. , 136-1341 (2009).</li>
<li>Nóbrega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmitotic+Nkx2-1+controls+the+migration+of+telencephalic+interneurons+by+direct+repression+of+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors.</a> Neuron. 59, 733-745 (2008).</li>
<li>Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+directions+for+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">New directions for neuronal migration.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).</li>
<li>Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+interneuron+migration+in+a+ferret+model+of+cortical+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia.</a> Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+neural+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li>
<li>Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+delivery+of+neurotrophins+into+the+central+nervous+system+using+fluorescent+latex+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres.</a> Biotechniques. 23, 928-937 (1997).</li>
<li>Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permissive+corridor+and+diffusible+gradients+direct+medial+ganglionic+eminence+cell+migration+to+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).</li>
<li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).</li>
</ol>

استخدام الحيوان : تم تنفيذ كافة الاجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا لمبادئ توجيهية USUHS والمعاهد الوطنية للصحة والمؤسسية التي وافقت عليها IACUC USUHS.

هنا نقدم نظام بسيط لدراسة وتحليل السلوك المهاجرة من الخلايا العصبية في استجابة لاشارات كيميائية في المختبر فحوصات الهجرة استخدمت لتحديد الجزيئات التي تؤثر على تنقل خارج الخلية من الخلايا. لدينا نموذج يضمن أن كل خلية فردية درس لديه 3 الأبعاد (3D) مع البيئة التي تتفاعل. انها ميزة كبيرة على الثقافات حيث تهاجر خلايا من explants يضطر للتحرك على سطح مستو من بولي - D - يسين المغلفة ساترة ، وبالتالي يخلو من التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال هرشبيرغ آخرون &#39;10؛ 8. ميتين وآخرون. &#39;07). لكن فيما يتعلق على نطاق أوسع لتعقب الخلايا المهاجرة ، فإنه لا يزال 2 الأبعاد ، كما هي مقيدة رأسيا الخلايا إلى المسافة بين ساترة الزجاج على السطح السفلي والعلوي من Matrigel ، وهي رقيقة نسبيا بالمقارنة مع الحرية الأفقي للهجرة. مثل هذا الإعداد يسمح لتسهيل تحليل الحركة ، والذي لا يزال أساسا 2 الأبعاد. كانوا يعملون سابقا نماذج 3D مماثلة تتألف من explants GE - المجاميع أو إعادة الخلايا GE جزءا لا يتجزأ من الكولاجين أو Matrigel ، وذلك باستخدام خلايا من الركام تعبر عن بروتين معين يشير كمصدر للإشارات الكيميائية (مثل Liodis آخرون &#39;07؛ مارتيني وآخرون . بن &#39;09؛ نوبريجا ، وآخرون بيريرا&#39;08 ؛ Wichterle آخرون &#39;03). الطريقة المعروضة هنا يستخدم نظام الإفراج البطيء في شكل حبات اللثي مع بروتينات انضمت للسماح لمستوى مستدام في البيئة المحلية ، وهي نسبة أعلى من البروتينات وأضاف مباشرة إلى المتوسط ​​، مما يجعل نظام مناسب خصوصا عندما يتوفر مبلغ غير محدودة من البروتين ، أو عندما يتم اختبار خليط معقد من البروتينات. لا يقتصر اختيار حبات لمادة اللاتكس المنتجات القائمة ، ويشمل أيضا مواد أخرى ، على سبيل المثال agarose الخرز ، ولكل منها خصائص مختلفة. وذلك لزيادة كثافة مقايسة ، وتستخدم نحن اثنان explants apposed لإيداع الخرز على طرفي نقيض. لضمان وجود منطقة محددة من الأصل ، وقد استخدمنا explants البارزة العقدية كمصدر للخلايا. قمنا بتقييم الاختلافات في أجزاء الإنسي والجانبية للفضيلة العقدية ، ولكن لم ير أي خلافات. وينبغي أن نشير إلى أن هذه الدراسة يستخدم قوارض ، وفي هذه الأنواع البوارز الإنسي والجانبية العقدية الصمامات في وقت سابق من القوارض (Poluch آخرون &#39;08). في الوقت الذي كان أدلى الثقافات (P0) كانت تنصهر في البوارز الإنسي والجانبية العقدية ، على الرغم من العديد من الخلايا لا تزال ملء المخية الحديثة التي يتم توليدها والمهاجرة. ومع ذلك ، إذا كان هو المفضل مصدر متجانسة حقا من الخلايا ، يمكن أن تكون على استعداد تعليق خلية من أنسجة تشريح والمختلط مباشرة مع Matrigel ، أو نسج أسفل بدلا من بيليه واللكم مما أدى إلى جعل &#39;explants. تم تخيف استخدام أنسجة الأنزيمية الهضم لإعداد التعليق الخلية ، بل بحثا عن آثار متبقية من نشاط بروتين يمكن تسييل Matrigel على مدار التجربة. أيضا ، وهو الحرص الواجب أن تطبق على توقيت الإعداد الثقافة. على الرغم من Matrigel يتطلب فترة من ارتفاع درجات الحرارة الى تتبلمر ، وحتى فترة ممتدة قليلا من التعرض لقطرات صغيرة من Matrigel (كما تستخدم في هذا البروتوكول) في الهواء يسبب التجفيف والنتائج في قذيفة التي لا يمكن اختراقها إلى الخلايا المهاجرة والتي لا يمكن محوها من من خلال تغطية لاحقة مع Matrigel الطازجة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </td><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> Neurobasal متوسطة (1X) والسائلة </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> N - 2 الملحق (100X) ، السائل </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B - 27 الملحق (50X) </td><td> Invitrogen </td><td> 0080085 - SA </td><td></td></tr><tr><td> دينار بحريني الغشاء القاعدي Matrigel ماتريكس </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td> هاريس أحادي النواة ، وحجم 0.5mm </td><td> الإلكترون المجهر العلوم </td><td> 69036-05 </td><td> لكمة تتحمل </td></tr><tr><td> الأخضر Retrobeads التاسع </td><td> Lumafluor ، وشركة </td><td></td><td> اللاتكس المجهرية </td></tr></tbody></table>

المهاجرة سلوك الخلايا المولدة في الثقافات سماحة العقدية

Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

الهجرة من الخلايا هي عملية مشتركة تؤدي الى تطوير ونضوج النظام العصبي المركزي الفقاريات (Hatten ، &#39;99). قشرة الدماغ تتكون من نوعين العصبية الأساسية : مثير والمثبطة. تنشأ هذه الخلايا في مناطق متميزة والهجرة الى القشرة على طول مسارات مختلفة (بيرلمان وآخرون ، &#39;98). interneurons المثبطة تهاجر من مصادر هامشية تحت القشرية ، ومعظمهم من مناطق مختلفة من الفضيلة العقدية (غيلمان وآخرون ، &#39;09؛ شو وآخرون ،&#39;04). يتطلب مراقبة حركتهم spatiotemporal الدقيقة التي تفرضها منبهات البيئية ، للسماح لإنشاء التهندس الخلوي السليم والربط في القشرة الدماغية (Caviness وراكيتش ، &#39;78؛ Hatten ،&#39;90 ؛ راكيتش ، &#39;90). لدراسة سلوك المهاجرة من الخلايا المتولدة في المناطق التكاثري للالبوارز العقدية (GE) في حديثي الولادة قوارض في المختبر استخدمنا 3 الترتيب الثقافة الأبعاد في مصفوفة Matrigel دينار بحريني. تألف الإعداد ثقافة explants GE اثنين ومصدرا للبروتينات اختبار المستخرج من قشرة الدماغ وكثف على الفلورسنت التاسع Retrobeads اللاتكس المتمركزة بين explants (Hasling آخرون ، &#39;03؛ ريدل وآخرون ،&#39;97). بعد 2-3 أيام من الثقافة ، وتبدأ الخلايا لتظهر على حافة يزدرع يظهر الميل إلى ترك الأنسجة في اتجاه شعاعي. التصوير مسموح يعيش رصد أنماط الهجرة من دون ضرورة لوضع العلامات أو الوسم الخلايا. عرض GE الخلايا عند تعرضها للكسور من البروتين الحصول عليها من استخراج القشرة isochronic النمس ، والسلوكيات المختلفة والحكم عليها من خلال التحليل الكمي لالحركية الفردية خلايا تتحرك.

وقت التصوير انقضاء زراعة الأنسجة 3D يسمح بدراسة سلوك الهجرة من الخلايا الفردية النابعة من سماحة العقدية كرد فعل لاستخراج البروتين مجزأة من القشرة الدماغية.

تعد هجرة الخلايا عملية شائعة تؤدي إلى تطور ونضج الجهاز العصبي المركزي في الفقاريات (Hatten, '99). أما المخ...

في هذا الإجراء، يتم إعداد مستنبت في المختبر لدراسة كيفية تأثر هجرة الخلايا من البروز العقدِي إلى القشرة المخية بواسطة أجزاء مختلفة من مستخلص بروتين القشرة. أولاً، يتم تحضين الكرات الدقيقة من اللاتكس مع أجزاء فردية لإعداد مصادر للبروتينات التي تُطلق ببطء. ثم يتم استئصال دماغ حيوان النمس وتقطيعه عرضياً إلى شرائح سميكة.يتم استئصال طعوم نسيجية من بروزات العقد العصبية. ثم يتم إعداد مزارع ثلاثية الأبعاد تحتوي على الكرات المجهرية والطعوم المدمجة في مادة خلوية خارج الخلية. وبعد فترة حضانة، يتم إجراء تسجيل صوري مخصص للفواصل الزمنية باستخدام مجهر الحقل المضيء.تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل استخدام غرفة الانجذاب الكيميائي، في إمكانية مراقبة حركات الخلايا الفردية وقياسها كمياً. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات تطور الجهاز العصبي، مثل التحكم الكيميائي والحركي في الحركة.بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة نظرًا لصعوبة التعامل مع مستنبتات الأنسجة الصغيرة مع matra gel. للبدء، قم بإذابة matra gel المجمد تدريجيًا على ثلج رطب لضمان بقاء درجة الحرارة منخفضة بما يكفي لمنع التصلب المبكر للمصفوفة أثناء عملية الإذابة. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح ثم قم بالتجميد السريع (slush freeze) لـ 500 milliliters من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي أو A CSF عن طريق وضع دورق بلاستيكي في مجمد بدرجة حرارة minus 80.عندما تتكون طبقة رقيقة من الجليد على الجدران، قم بتكسيرها عن طريق رج القارورة، ثم اسمح بتكوين طبقة أخرى من الجليد وكرر العملية حتى يتكون ملاط متجانس. بعد ذلك، قم بتحضير الوسط الغذائي العصبي الأساسي (neuro basal medium) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة وعقمه عن طريق الترشيح. استخدم غشاء ترشيح بمسام 0.22 µm واحضنه عند 37 °C حتى يصبح جاهزاً للاستخدام لامتصاص جزء البروتين على الكريات المجهرية أو الخرزات اللاتكس الفلورية من أجل الانتشار في الماتريجيل (matrigel)، ثم أضف 10 µL من الخرزات إلى أنابيب EOR تحتوي بشكل منفصل على 100 إلى 200 µL من كل جزء من أجزاء البروتين الخمسة المختلفة.تُحضن العينات في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز. وبعد انتهاء فترة التحضين التي استغرقت 30 دقيقة، يتم ترسيب الخرز باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي بالسرعة القصوى لمدة ساعة واحدة. وبعد تخدير الحيوان تخديرًا عميقًا باستخدام uol، يتم استئصال الدماغ بالكامل وغمره في A CSF المبرد مسبقًا والمجهز في الثلج.افصل نصفي الكرة المخية تماماً باستخدام المشرط، وقم بتقطيع التاج (Corona) إلى شرائح بسمك 500 micrometers. باستخدام قطاعة أنسجة أو جهاز مماثل، اجمع الشرائح في طبق بتري صغير يحتوي على A CSF بارد جداً وموضوع على ثلج مبلل. وباستخدام مجهر التشريح، حدد الشرائح التي تحتوي على البروزات العقدية (ganglionic eminences) أو ge، وقم بقص مناطق القشرة التي قد تعيق الخطوات اللاحقة.اضغط بمثقاب Harris unicorn في المنطقة القريبة من السطح البطيني للـ GE. اسحب لباً يحتوي بشكل أساسي على المنطقة البطينية وادفعه باستخدام مكبس إلى وسط neuro basal مبرد بالثلج. انقل مجموعة من الغرسات من الوسط إلى قطرة بحجم 0.5 milliliter من mat gel مبرد بالثلج موضوعة في طبق منفصل.مع الحرص على غمر المستأصل بالكامل وتجنب تكون الفقاعات. يُحفظ الطبق على ثلج رطب أثناء العمل داخل غطاء زراعة الأنسجة. قم بتحضير المزرعة.قم بتحضير أطباق الآبار ذات الستة صفوف عن طريق وضع نقطتين من Matrigel البارد بحجم 2 µL في مركز كل بئر. استخدم طرف ماصة بحجم 20 µL لوضع شريحة غطاء زجاجية مستديرة بقطر 18 mm ومعقمة بجهاز الأوتوكلاف فوق كل قطرة. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخرزات في 10 µL من الوسط الغذائي العصبي (neuro basal medium) باستخدام جهاز الـ vortex، أو أضف 30 µL من Matrigel المذاب على الثلج إلى المعلق.امزج جيداً وضع المزيج على الثلج. وباستخدام المجهر التشريحي، ضع من 1 إلى 2 µL من معلق الخرز باستخدام ماصة سعة 20 µL واتركه لمدة دقيقة إلى دقيقتين، مع الحرص على عدم جفافه. التقط اثنين من x explan من قطرة الـ matri gel وضعهما في المنطقة المطلوبة بجوار ترسب الخرز.على مسافة تتراوح بين 0.5 إلى 1 مليمتر، بشكل متماثل وعلى جانبين متقابلين. لنتركها لمدة لا تزيد عن خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطية الخرز في X eggplants بطبقة مسطحة تبلغ حوالي 30 µL من matrigel، ثم ضعها في حضانة زراعة أنسجة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 15 دقيقة، وبعد الحضانة أضف 2 mL من neuro basal medium، ثم أعدها إلى الحضانة لمدة تتراوح من ثلاثة إلى أربعة أيام.عند مراقبة نشاط الهجرة يومياً بعد التحضين، اختر شرائح التغطية ذات الاهتمام والتي تحتوي على غرسات أنتجت سحابة من الخلايا موزعة بشكل شعاعي منتظم. ضع شرائح التغطية المختارة في طبق زراعة جديد وحضنها طوال الليل. وقبل التصوير، استخدم ملعقة معقمة داخل غطاء زراعة الأنسجة لتحريك شريحة التغطية من أجل تحرير أي فقاعات مجهرية من تحتها.املأ الفراغات بين الآبار بالماء لمنع الجفاف، وانقل الطبق بعناية إلى المجهر. باستخدام برنامج التصوير، حدد مخطط التصوير، مع الحرص على مراعاة الطبيعة ثلاثية الأبعاد للمزرعة من خلال جمع سلسلة من المقاطع العرضية في المستوى z.بمجرد ضبط المعلمات، ابدأ التصوير بفاصل زمني. يظهر هنا تسجيل تصويري بفاصل زمني ممثل لعقدة عصبية، حيث تقوم البروزات التفسيرية (eminence explan) بتوليد خلايا مهاجرة. تهاجر الخلايا شعاعياً إلى خارج النسيج.يختلف انجذابها لمصدر البروتين اعتماداً على طبيعة هذا المصدر. وفي هذا المقطع المصور بقوة تكبير أعلى، يمكن تتبع الخلايا المتحركة الفردية بسهولة. وكما تشير رؤوس السهام، يظهر العديد من الخلايا في حالة تفرع.تم الإشارة إلى عدد قليل من هذه الخلايا باستخدام الأسهم. يوفر تتبع الخلايا الفردية معلومات موضعية يمكن تحليلها بشكل أكبر. وتظهر المخططات البيانية كمثال استجابة تفاضلية بين الكسرين A وD، كما يتضح من المسارات المتميزة للخلايا التي تغادر المستأصل. بمجرد إتقان ذلك.يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون أربع ساعات إذا تم تطبيقها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر إبقاء هلام المصفوفة (mat gel) على الثلج. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير مصدر بطيء التحرر للبروتينات، وإعداد مزرعة نسيجية ثلاثية الأبعاد، وإجراء تصوير بالفاصل الزمني لمراقبة وتحليل حركات الخلايا الفردية.

migratory-behavior-of-cells-generated-in-ganglionic-eminence-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

في هذا البروتوكول ونحن لشرح كيفية بناء الغرف المخصصة التي تسمح بتطبيق حقل كهربائي مباشر الحالية لتمكين الوقت الفاصل بين التصوير من الدماغ العصبية مشتقة الكبار إزفاء الخلية تمهيدا خلال انجذاب غلفاني.

A الفحص انجذاب غلفاني لتحليل حركية العصبية السلائف الهجرة خلية في الحقل الحالي مباشرة التطبيقية خارجيا الكهربائية

نحن هنا وصف خلية شوان (SC) مقايسة الهجرة التي الطوائف المنبوذة هي قادرة على تطوير محاور عصبية على طول تمديد.

تحليل الفئران خلايا شوان التنمية جنبا إلى جنب المحوار النامي

نقدم بحكم فيفو خلية مقايسة الهجرة التي تسمح الكمي الدقيق للالمعوي العصبية المحتملة الهجرة الخلية قمة في وجود عوامل النمو المختلفة.

مقايسة الهجرة الخلية الكمي لالفئران العصبية المعوية أسلاف

نماذج ثقافة الخلية توفر تحكم مفصلة على الظروف البيئية وبالتالي توفر منصة قوية لتوضيح جوانب عديدة من بيولوجيا الخلايا العصبية. نحن تصف طريقة سريعة وغير مكلفة، وموثوق بها لعزل وفصل، والثقافة الخلايا العصبية الحسية من الأجنة الفرخ. كما تقدم تفاصيل إعداد الطبقات التحتية ومناعية.

العزلة وثقافة فصل الخلايا العصبية الحسية من الفرخ الأجنة

الظهارية إلى الانتقال اللحمة المتوسطة (EMT) تسمح للسرطانات بأن تصبح غازية. للتحقيق في EMT ، يتم وصف نموذج مختبري قائم على الخلايا الجذعية العصبية (NSC) خال من المصل والإنزيمات. يسمح هذا النظام الموحد بالتقييم الكمي والنوعي لهجرة الخلايا والتعبير الجيني والبروتيني. النموذج مناسب لاكتشاف الأدوية.

نموذج الانزيمات والمصل خالية من العصبية الثقافة الخلايا الجذعية لEMT التحقيق مناسبة للاكتشاف المخدرات

هنا نقدم السابقين فيفو مختلطة نظام الثقافة أحاديه الطبقة لدراسة الهجرة الخلية البشرية الورم (hGC) في الوقت الحقيقي. يوفر هذا النموذج القدرة علي مراقبه التفاعلات بين عارضه والمحاور النخاعية وغير النخاعية داخل غرفه مجزاه.

في الوقت الحقيقي رصد الهجرة الخلية البشرية الورم علي العقدة الجذر الظهرية اكسون-اوليغوداندورونسيتي الثقافات المشتركة

نقدم ثلاثة بسيط في المختبر ومقالات الهجرة لمسافات طويلة ، والدراسة المشتركة للهجرة الثقافة ، والكيميائية جاذبية الجاذبية والمواد التي تقيم بشكل جماعي وظائف الخلايا الجذعية البشرية المستمدة الخلايا البطانية التشعبية ولهم التفاعل مع الخلايا العصبية المشتركة GABAergic.

الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic

الـ(غانغليا) الفرخ (CG) هي جزء من الجهاز العصبي اللالامبالي. وقد تبين الثقافات العصبية من الخلايا العصبية CG فرخ لتكون نماذج الخلايا الفعالة في دراسة التفاعلات العضلية العصبية. نحن نصف بروتوكول مفصل لتشريح, تفكك والثقافة في المختبر من الخلايا العصبية CG من الأجنة فرخ.

العزلة والثقافة من الفرخ Ciliary الخلايا العصبية جانجليون

هنا، نقدم اختبار الثقافة المشتركة سهلة الاستخدام لتحليل الورم الأرومي الدبقي (GBM) الهجرة على الخلايا العصبية المنقوشة. قمنا بتطوير ماكرو في برنامج FiJi لسهولة تحديد كمي لهجرة خلايا GBM على الخلايا العصبية ، ولاحظنا أن الخلايا العصبية تعدل قدرة الخلايا الغازية GBM.

الثقافة المشتركة للخلايا الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية

يصف هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات عزل خلايا القمة العصبية المهاجرة (NCCs) من خلال استئصال الطيات العصبية القحفية من أجنة الكتاكيت. عند الطلاء والحضانة ، تظهر NCCs المهاجرة من الطيات العصبية ، مما يسمح بتقييم مورفولوجيا الخلية والهجرة في بيئة 2D مبسطة.

إعداد وتحليل مورفولوجي لمزارع خلايا القمة العصبية القحفية للكتكوت

يصف هذا البروتوكول طرق إنشاء ثقافات كاملة ومنفصلة للعقد الجذرية الظهرية للفأر (DRG) واستخدامها لتقييم تفاعلات الورم والعصب.

إنشاء نماذج في المختبر لثقافة العقد الجذرية الظهرية: مناهج تكميلية للتحقيق في الحديث المتبادل بين السرطان والأعصاب

اكتشف سلوك الهجرة الخلوية في علم الأعصاب التنموي باستخدام تقنية التصوير الزمني للثقافات ثلاثية الأبعاد. تتيح هذه الطريقة مراقبة حركات الخلايا الفردية وتحليل استجاباتها الكيميائية الحركية بدقة عالية.

المهاجرة سلوك الخلايا المولدة في الثقافات سماحة العقدية

استكشف المزيد من الفيديوهات