Name: الوسم نسب خلايا اسماك الزرد مع فلوريسئين الليزر ديكستران Uncagable (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: تعلم تقنية الوسم النسبي للخلايا في أجنة أسماك الزرد باستخدام الفلوريسئين المحبوس والليزر فوق البنفسجي. تتيح هذه الطريقة تتبع مصير الخلايا المحددة عبر المجهر المناعي الضوئي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر دان كارلين للحصول على مساعدة في صنع فلوريسئين مطلقة السراح. بالإضافة نود أن نشكر مصادر التمويل التالية : مدرسة الطب بجامعة فاندربيلت البرنامج التنموي لعلم الأحياء المنح التدريبية لJAC ، والمعاهد الوطنية للصحة JTG HD054534to.

1. توليف ديكستران فلوريسئين محبوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس خارج 3،5-4 ملغ من aminodextran وإضافة إلى أنبوب Invitrogen الموفر ملون يحتوي على 1 ملغ من CMNB SE - قفص فلوريسئين. في أيدينا هذه النسبة يعطي متوسط ​​التحميل من الجزيئات ~ 2.5 في صبغ ديكستران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من 0.1 م نا العازلة B 2 O 7 (بورات الصوديوم) من 4 إلى الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبعة ودوامة لمدة 30 ثانية ليحل aminodextran وفلوريسئين مطلقة السراح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا تتفاعل بين عشية وضحاها على خلاط vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطور قبالة إغلاق أسفل على عمود الدوران زيبا وتخفيف الغطاء. علامة نقطة على العمود بالقلم شعرت معلومات سرية. مكان العمود في أنبوب 15 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة مع النقطة التي تواجه وسط الدوار. استخدام العمود مباشرة بعد ضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان العمود ضغط في أنبوب 15 مل جديدة المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع خليط التفاعل ونقل إلى مركز للسرير عمود الراتنج المضغوط. استبدال الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة مع النقطة التي تواجه وسط الدوار. بعد زيادة ونقصان ، فإن شاطف والجزء العلوي من العمود تكون تقريبا نفس الظل أصفر اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شاطف الأصفر (~ 350 ميكرولتر) إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize إلى جفاف في speedvac. تغطية speedvac مع احباط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق الناتجة ~ 2-3 ملغ من الرغوة صفراء باهتة في الماء لتركيز النهائي من 1 ٪ ث / v. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذا الحل في تخزين -20 درجة مئوية في احباط أنابيب مغطاة. انها فكرة جيدة لديكستران قسامة الحل لمنع تجميد الذوبان المتكررة. </li></ol> 2. حقن ديكستران فلوريسئين محبوس في اجنة اسماك الزرد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخفف 1 ٪ وزن / حجم المخزون من قفص 01:05 ديكستران فلوريسئين أو 01:10 في بوكل 0.2M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 0.5 -- 1.0nL حل فلوريسئين في قفص واحد صفار أجنة باستخدام خلايا المرحلة حاقن الضغط. حقنه مرة واحدة ، يجب أن تبقى براثن الأجنة في الظلام على 28،5 درجة مئوية للحد من uncaging غير محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة يدويا chorions من أجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأجنة في tricaine 4 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقام الأجنة في agarose 0.8 ٪ في طبق بتري 35mmx10mm ، ثم تغطى البيض مع الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن agarose ذابت في حرارة 50 درجة مئوية لمنع ما لا يقل عن 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الزجاج ، ووضع في جنين واحد على كمية ضئيلة من المياه والإفراج عنها في agarose ملاحظة : من المهم لتبريد أنبوب agarose في يدك لمدة 30 ثانية تقريبا قبل وضع الجنين في أنبوب لتفادي قتل الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة الجنين من الأنبوب ، جنبا إلى جنب مع ما يقرب من 50μL agarose وإخراج محتوياتها على مركز للطبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه بسرعة الجنين باستخدام خيط من البلاستيك مع الخلايا لتكون uncaged مواجهة ملاحظة : agarose مع يبرد بسرعة حتى تكون متسرعة مع توجيه الجنين. يمكن أن تتلف الأجنة إذا التلاعب بعد agarose تصبح جامدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لترسيخ agarose تماما (وهذا يستغرق بضع دقائق) وملء الطبق 2 / 3 كامل مع المياه التي تحتوي على البيض tricaine 4 ٪ و 0.003 ٪ PTU. </li></ol> 3. الليزر Uncaging من ديكستران فلوريسئين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تستخدم لمجهر uncaging لها الغمر بالمياه 40X الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم اجهزة ليزر الضوئيات مع الخلية 365 نانومتر صباغة و70 ٪ / 30 ٪ مرآة انقسام مزدوج اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل uncaging ، يجب بذل الليزر مستتب البؤرتين مع هدف والموهنة للسلطة الملائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتركيز الليزر ، ووضع شريحة زجاجية معكوسة في إطار الهدف والتركيز على الهدف حتى خدوش في الشريحة مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الليزر المخفف حتى ليزر يمكن أن يؤدي إلى نقطة الصفر واضحة للعيان في المرآة مع نبضة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط التركيز الهدف صعودا وهبوطا. إذا كان ليزر يمكن أن يؤدي إلى نقطة الصفر عندما كان الهدف هو الخروج من التركيز وضبط تركيز الليزر ¼ بدوره صعودا أو هبوطا. أكرر حتى ليزر يمكن التسويد في المرآة فقط عندما يتركز الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شنت مكان الجنين في إطار الهدف والتركيز على المنطقة المراد uncaged. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لuncage ، والتركيز على خلية من الاهتمام وأنه نبض 1-20 مرات في 03/02 هرتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد uncaging ، حرر الجنين عن طريق تقشير agarose بعيدا مع ملقط ووضعها في الماء البيض التي تحتوي على PTU 0.003 ٪. اسمحوا تطوير الأجنة في ضوء مربع محكم حتى يتم إصلاح عليها. </li></ol> 4. وضع العلامات والكشف عن الأجسام المضادة ديكستران فلوريسئين Uncaged <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (1X التخزين المؤقت الفوسفات بارافورمالدهيد 4 ٪ ، 0.3mM CaCl 2 ، 8 ٪ سكروز ، المالحة ، ودرجة الحموضة 7.3) إصلاح الأجنة في تثبيتي أب لمدة سنتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT) ، أو بين عشية وضحاها (O / N) في 4 درجات مئوية. إبقاء الأجنة في مربع ضيق الخفيفة أو أنبوب احباط الملفوفة لجميع الخطوات التوسيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيتي ، واستبدال MeOH 100 ٪ ، وتترك لمدة 10 دقيقة على RT ، وإزالة MeOH replaم مع MeOH الطازجة بنسبة 100 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر في MeOH عند درجة -20 لما لا يقل عن 30 دقيقة ملاحظة : يمكنك تخزينها في MeOH لمدة تصل إلى أسبوعين قبل أن تبدأ الحواتم أن تتحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترطيب الأجنة مع 5 يغسل دقيقة في RT MeOH/1X للفوسفات 75 ٪ مخزنة المالحة بنسبة 0.1 ٪ توين 20 (1X PBSTw) ، ثم 50 ٪ 1XPBTw MeOH/50 ٪ ثم 25 ٪ MeOH/75 ٪ 1X PBSTw. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في 1XPBSTw. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا الأجنة&gt; 24 ساعة من العمر ، permiabilize الأجنة مع 10 ميكروغرام / مل بروتين كاف في 1XPBSTw. الوقت Permiabilization يعتمد على خشبة المسرح. خمس دقائق في K بروتين كاف إذا الأجنة ما بين 24 و 48 ساعة بعد الإخصاب (HPF). قد تكون هناك حاجة الى مزيد من الوقت إذا كان لكبار السن من اليرقات. إعادة الإصلاح في تثبيتي ، أب لمدة 20 دقيقة في RT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل خمس مرات لمدة 5 دقائق في 1XPBSTw في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في حل كتلة (1XPBS ، 0.1 ٪ X100 تريتون ، و 10 ٪ مصل الأغنام والأبقار 10 ٪ مصل الزلال ، ثنائي ميثيل سلفوكسيد 1 ٪) لمدة 1-2 ساعات في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأضداد الابتدائي (المضادة للفلوريسئين زائد أجسام مضادة ضد خلايا من نوع علامات محددة) في عرقلة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجنة احتضان O / N عند 4 درجة مئوية في محلول يحتوي على الأجسام المضادة الأولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أربع مرات لمدة 20 دقيقة في 1XPhosphate التخزين المؤقت مع المؤسسة العامة لتحلية X100 تريتون 0.1 ٪ (PBSTx) في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع fluorescently المسمى الأجسام المضادة الثانوية (1:300 عادة) في عرقلة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان O / N عند 4 درجة مئوية في محلول يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أربع مرات لمدة 20 دقيقة في 1XPBSTx في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجنة واضحة في 1XPBS 50 ٪ glycerol/50 ٪ لمدة ساعتين على الأقل في RT ، ثم إزالة الجلسرين / PBS الخليط ويضاف الجلسرين بنسبة 100 ٪ واسمحوا الوقوف O / N عند 4 درجات مئوية. </li></ol> 5. ممثل النتائج : بعد immunolabeling ، ينبغي أن يكون هناك مساحة من تلطيخ المخصب في الخلايا التي تم uncaged (Figure.1). ليس من غير المعتاد أن نرى إشارة إلى نسبة عالية نسبيا من الضوضاء في&gt; الزرد 48 ساعة القديمة ، ويرجع ذلك إلى uncaging عفوية من فلوريسئين. <img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. وسم النسب المعقدة الزرد الصنوبرية. وقد برز uncaged GFP التعبير ، وذلك باستخدام نبضات الليزر الأشعة فوق البنفسجية A) بواسطة 48hpf ، كتلة في الجانب الايسر من الخلايا تسمى صنيبري (دائرة حمراء) من uncaged : في 24 HPF ، وهو جزء من بدأة في الصنوبرية الأمامي الذي يشار إليه بواسطة foxd3. المجال (دائرة بيضاء). B) هو أثرى Uncaged فلوريسئين إشارة في الدائرة (صنيبري الحمراء) والجهاز الصنوبرية (دائرة بيضاء)

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuC%3AKaede%2C+a+useful+tool+to+label+neural+morphologies+in+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo.</a> Genesis. 44, 136-142 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+Fluorescent+Probes+and+Research+Chemicals%22">Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals</a>. , 9th Edition, 707-711 (2002).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

كما هو موضح ، هذا البروتوكول يتيح وضع العلامات النسب سريع نسبيا في الزرد أن الأسلوب المبني على التقنيات المستخدمة عادة من microinjection ، المجهري ، والمناعي. لقد وجدنا أن ليزر uncaging أن يكون الوسيلة الأكثر فعالية وأقل تكلفة لuncage فلوريسئين بطريقة المترجمة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتسمية النسب مع نهايات تجريبية في وقت متأخر من 4 DPF. لكن ، وكما انقسام الخلايا ، وتركز في قفص - فلوريسئين لكل خلية انخفاضا في نهاية المطاف إلى ما بعد المستويات التي يمكن اكتشافها. بالإضافة إلى ذلك...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2672">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran</a>. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to: Ilya A. Shestopalov and James K. Chen instead of: Ilya Shestopalov and James Chen

A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>فلوريسين SE المقيد بـ CMNB</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>أمينوديكستران، 10 كيلو دالتون</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>أعمدة الغزل لإزالة الأملاح Zeba</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>جسم مضاد للفلوريسين من الماعز</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>جسم مضاد من الحمير مضاد للماعز مُوّسم بـ Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>أطباق بتري مقاس 35 مم × 10 مم</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>مجهر مركب رأسي مزود بعدسة شيئية غمر مائي بقوة تكبير 40x</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>نظام MicroPoint للإضاءة بالليزر اليدوي</td><td>الأجهزة الفوتونية</td><td></td><td></td></tr><tr><td>فينيل ثيويوريا (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>تريكاين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>بروتيناز K</td><td>مجموعة روش (Roche Group)</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>خيط بلاستيكي</td><td>أي مورد</td><td></td><td></td></tr><tr><td>أجاروز</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>جهاز SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>خلاط دوامي</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>محقن الضغط</td><td>الأجهزة العلمية التطبيقية</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

الوسم نسب خلايا اسماك الزرد مع فلوريسئين الليزر ديكستران uncagable

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

وتتمثل المشكلة الرئيسية في البيولوجيا التطورية هو استدلال على الأصل من عدد لا يحصى من أنواع الخلايا الموجودة في الفقاريات لأنها تنشأ من السلائف غير متمايزة. الباحثون قد استخدمت أساليب مختلفة لوضع العلامات النسب ، مثل وضع العلامات الجاذبة (1) وحقن ضغط الانزيمات يمكن عزوها 2 إلى مصير الخلية التحقق في مراحل لاحقة من تطور في نظم النموذج. تم تجميع الخرائط مصير الاولى في الزرد (دانيو rerio) عن طريق الحقن iontophoretic من الأصباغ الفلورية ، مثل ديكستران رودامين ، إلى خلايا في مناطق منفصلة واحدة من الجنين وتتبع مصير الخلية المسمى على مر الزمن 3-5. في حين فعالة ، وهذه الأساليب يطالبون تقنيا وتتطلب معدات متخصصة لا توجد عادة في المختبرات الزرد. في الآونة الأخيرة ، والبروتينات الفلورية photoconvertable ، مثل إيوس Kaede الذي والذي لا رجعة فيه التبديل من الأخضر إلى الأحمر عند تعرضها مضان للأشعة فوق البنفسجية ، نشهد زيادة في استخدام الزرد 6-8. جعلت من الوضوح البصري للجنين الزرد والسهولة النسبية لهذه الأدوات transgenesis جاذبية خاصة لوضع العلامات ونسبها لمراقبة الهجرة من الخلايا في الجسم الحي 7. على الرغم من فائدتها ، وهذه البروتينات وبعض العيوب مقارنة صبغ بوساطة طرق وضع العلامات النسب. الحاسمة الأكثر صعوبة هو أننا وجدنا في الحصول على أعلى مستوى خلال 3 - D القرار خلال photoconversion من هذه البروتينات. في ضوء ذلك ، وربما أفضل مزيج من القرار ، وسهولة الاستخدام لوضع العلامات النسب في الزرد يجعل من استخدام ديكستران فلوريسئين قفص ، صبغة الفلورسنت المنضم إلى مجموعة التبريد التي أقنعة 9 في مضان. يمكن أن تكون الصبغة ثم &quot;uncaged&quot; (صدر من مجموعة التبريد) داخل خلية معينة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية من مصباح الليزر أو الزئبق ، مما يسمح للتصور ، أو مضان مناعي. خلافا لأساليب iontophoretic ، يمكن حقنه في قفص فلوريسئين مع الأجهزة القياسية وحقن uncaged مع مجهرا epifluorescence مجهزة ذات الثقب 10. بالإضافة إلى ذلك ، كشف عن الأجسام المضادة ضد فلوريسئين فقط على شكل uncaged ، وكذلك تثبيت حاتمة ينجو 11. أخيرا ، يمكن تفعيلها فلوريسئين قفص مع القرار 3 - D عالية جدا ، خصوصا إذا كان يعمل المجهر ثنائي الفوتون 12،13. يصف هذا البروتوكول وسيلة لوضع العلامات النسب التي فلوريسئين قفص uncaging والليزر. Subsequenctly ، يتم الكشف عن uncaged فلوريسئين بالتزامن مع الحواتم أخرى مثل وضع العلامات التي GFP مع الأجسام المضادة.

ويحدد هذا البروتوكول وسيلة لتسمية وتتبع مصير مجموعات صغيرة من الخلايا باستخدام الأجنة الزرد للأشعة فوق البنفسجية من uncaging فلوريسئين قفص ، يليه جبل بأكمله immunolabeling لتضخيم إشارة من فلوريسئين uncaged.

الوسم نسب خلايا اسماك الزرد مع فلوريسئين الليزر ديكستران Uncagable

تتمثل إحدى المشكلات المركزية في علم الأحياء التنموي في استنتاج أصل الأنواع الخلوية التي لا حصر لها والموجودة في الفقاريات، بينما تنشأ هذه الأنواع من خلايا غير متمايزة...

الهدف العام من هذا الإجراء هو وضع علامات تتبع سلالة الخلايا في جنين سمكة الزيبرا. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تخليق الفلوريسين المتقيد (caged fluorescein) وحقنه في أجنة سمكة الزيبرا. بعد ذلك، يتم تثبيت الأجنة في الآجار بحيث يمكن الوصول إلى الخلايا المراد وسمها.بعد ذلك، يُستخدم ليزر UV لتنشيط الفلوريسين المقيد في خلايا مختارة من الجنين. وأخيراً، تُجمع الأجنة بعد وصولها إلى المرحلة النمائية المطلوبة، ويتم الكشف عن الخلايا الموصومة بالنسبة لعلامات سلالات خلوية معينة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تُظهر مصير الخلايا المختارة في الأجنة من خلال عملية إزالة القيد الضوئي والمجهر الفلوري المناعي.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالتقنيات الحالية مثل التحويل الضوئي لـ Cade، في أن التألق المناعي متعدد الألوان يمكنه الكشف عن الفلوريسين غير المقيد بالإضافة إلى الأجسام المضادة الأخرى الخاصة بربط الخلايا. لحقن ديكستران الفلوريسين المقيد في أجنة سمك الزيبرا، قم أولاً بتخليقه وتحضيره بتركيز 1% وزن/حجم. قم بتقسيم المخزون إلى حصص وفقاً للبروتوكول المكتوب المرفق.بعد ذلك، يتم تحضير جزء من المخفف بنسبة 1 إلى 5 أو 1 إلى 10 في كلوريد البوتاسيوم بتركيز 0.2 molar. ثم يتم حقن 0.5 إلى 1 nanoliter من محلول الفلوريسين المقيد (caged fluorescein) في مح yolk لأجنة في مرحلة خلية واحدة. وباستخدام حاقن ضغطي، يجب الاحتفاظ بمجموعات الأجنة بعد الحقن في الظلام عند درجة حرارة 28.5 °C لتقليل عملية فك التقييد (uncaging) غير النوعية حتى الوصول إلى المرحلة التنموية المطلوبة.أزل الغشاء الكوريوني يدويًا من الأجنة، ثم خدر الأجنة في 4% tricaine لتحقيق توازن الأجنة عند التثبيت، واستخدم 0.8% agarose مذاب في كتلة تسخين عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل. بعد ذلك، برد الأنبوبة في يدك لمدة 30 ثانية تقريبًا. وقبل إضافة الأجنة، اسحب جنينًا واحدًا باستخدام ماصة زجاجية في أقل كمية ممكنة من الماء وأفلته في الـ agarose. اسحب الجنين من الأنبوبة مع حوالي 50 µL من الـ agarose وافرغ المحتويات في مركز طبق بتري مقاس 35 ملم × 10 ملم.باستخدام خيط بلاستيكي، قم بتوجيه الجنين بسرعة بحيث تكون الخلايا المراد تحريرها (uncaged) متجهة للأعلى. اترك agarose يتصلب تماماً ويملأ الطبق. املأ ثلثي الطبق بماء البيض الذي يحتوي على 4% trica و 0.003% PTU، واحفظ الأجنة في صندوق محكم الإغلاق ضد الضوء حتى بدء عملية التحرير (uncaging).لإجراء عملية تحرير الفلوريسين ديكستران بالليزر (laser uncaging)، استخدم مجهراً مركباً مزوداً بعدسة شيئية غمر مائي بقوة 40x. نحن نستخدم ليزر من شركة Photonics Instruments مع خلية صبغة بطول موجي 365 نانومتر ومرآة ثنائية اللون مقسمة بنسبة 70%30% قبل عملية التحرير. يجب ضبط الليزر ليكون متوافق البؤرة (par focal) مع العدسة الشيئية وتخفيف شدته إلى القدرة المناسبة لتركيز شعاع الليزر.ضع شريحة زجاجية عاكسة تحت الشيئية، ثم قم بضبط بؤرة الشيئية حتى تظهر الخدوش الموجودة في الشريحة. اضبط مخفف الليزر حتى ينتج الليزر خدشاً مرئياً بوضوح في المرآة بنبضة واحدة، مع ضبط تركيز بؤرة الشيئية صعوداً وهبوطاً. إذا كان الليزر قادراً على إحداث خدش عندما تكون الشيئية خارج نطاق البؤرة، فقم بتعديل بؤرة الليزر بمقدار ربع دورة.قم بالزيادة أو النقصان. كرر العملية حتى يتمكن الليزر من خدش المرآة. فقط عندما يتم ضبط تركيز العدسة الشيئية، ضع الجنين المثبت تحت العدسة الشيئية، ثم ركز على المنطقة المراد تحريرها لإتمام عملية التحرير الضوئي.ركز على الخلية المستهدفة وقم بتحفيزها بنبضات تتراوح من 10 إلى 20 مرة بتردد يتراوح بين 2 إلى 3 هرتز. بعد عملية إزالة القفص (uncaging)، حرر الجنين عن طريق إزالة الأغشية باستخدام الملقط ووضعه في ماء البيض الذي يحتوي على 0.003%PTU. قم بتثبيت الأجنة في مثبت الأجسام المضادة لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة، أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.أزل المثبت واستبدله بالميثانول بتركيز 100%. اترك العينة لتحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أزل الميثانول واستبدله بميثانول جديد بتركيز 100%.يُحفظ الجنين في الميثانول عند درجة حرارة 20- درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. ويمكن التخزين في الميثانول لمدة تصل إلى أسبوعين قبل أن تبدأ المستضدات في التحلل. أعد ترطيب الأجنة عن طريق إجراء غسلات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة باستخدام 75% ميثانول و 25% من محلول phosphate buffered saline بتركيز 1x مع 0.1% tween 20، ثم 50% ميثانول و 50% من محلول 1 XPBS tween 20، ثم 25% ميثانول و 75% من محلول 1 XPBS tween 20، ثم الغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في محلول 1 XPBS tween 20.إذا كان عمر الأجنة أكثر من 24 ساعة، يتم نفاذها باستخدام 10 µg/mL من Proteinase K في محلول XPBS tween 20. يعتمد وقت النفاذ على مرحلة الجنين، وتعتبر خمس دقائق في protease K كافية.إذا كانت الأجنة تتراوح أعمارها بين 24 و48 ساعة بعد الإخصاب، فقد يتطلب الأمر وقتاً أطول لليرقات الأكبر سناً. أعد تثبيت الأجسام المضادة باستخدام مثبت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأجنة خمس مرات لمدة خمس دقائق في محلول XPBS tween 20 في درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، يتم التحضين في محلول الحجب لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة. يتم تخفيف الأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب، ثم تُحضن الأجنة طوال الليل في درجة حرارة 4 °C في محلول يحتوي على الأجسام المضادة الأولية. وفي الصباح التالي، تُغسل الأجنة أربع مرات في محلول 1X PBS Triton X 100، ثم يتم تخفيف الأجسام المضادة الثانوية المفلورة في محلول الحجب.يتم تحضين الأجنة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في محلول يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية. بعد الغسل أربع مرات في 1x PBS Triton X 100، يتم ترويق الأجنة في خليط مكون من 50% glycerol و 50% 1x PBS لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ثم يتم إزالة خليط glycerol PBS وإضافة 100% glycerol والتحضين طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.تظهر النتائج الممثلة ليرقات المجموعة الضابطة واليرقات التي خضعت لفك القفص الضوئي في شكل مساقط مجهرية بؤرية. حُقنت أجنة المجموعة الضابطة بفلوريسين مقيد ولكنها لم تخضع لعملية فك القفص الضوئي بعد 48 ساعة من الإخصاب. يُظهر جنين المجموعة الضابطة وسم GFP في المجمع الصنوبري.يظهر بعض الوسم الخلفي النقطي، ولكن لا يمكن الكشف عن أي تراكم موضعي للفلوريسين الموسوم. تُظهر الأجنة التي خضعت لعملية فك القفص الضوئي تراكمًا واضحًا للفلوريسين المفكك في بعض الخلايا الموسومة بـ GFP. هذه هي الخلايا المنحدرة من الخلايا التي استهدفتها عملية فك القفص الضوئي قبل 24 ساعة مع إدخال تعديلات طفيفة.يمكن استخدام هذا الإجراء لتحديد السلالة الخلوية لأي نسيج تقريباً في جنين سمكة الزيبرا قبل مرور 48 ساعة على الإخصاب.

lineage-labeling-zebrafish-cells-with-laser-uncagable-fluorescein

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يصف هذا البروتوكول التصوير من الخلايا العصبية الفردية أو الخلايا العصبية في قمة العيش الأجنة الزرد. ويستخدم هذا الأسلوب لدراسة سلوكيات الخلوية والتوطين أكتين باستخدام مضان مبائر الوقت الفاصل بين المجهري.

يعيش التصوير في القدرة على الحركة والهيكل الخلوي أكتين خلية من الخلايا العصبية الفردية والخلايا العصبية في الأجنة كريست اسماك الزرد

المفتاح لفهم العمليات التي تشكل تخلقية الجنين في وقت مبكر هو القدرة على الخلايا في صورة عالية الدقة. نحن هنا وصف تقنية لوضع العلامات خلايا مفردة أو مجموعات صغيرة من الخلايا في الأجنة الزرد كله مع غشاء استهداف بروتين الفلورية الخضراء.

التوسيم وخلايا الدماغ المؤخر التصوير في اسماك الزرد

خلايا الموت تنبثق من الأنسجة الطلائية التي تقلص متضافرة من الخلايا المجاورة دون تعطيل وظيفة الحاجز. الوضوح البصري الزرد النامية يوفر نظاما ممتازا لتصور البثق في العيش ظهائر. نحن هنا وصف أساليب للحث على صورة وقذف في البشرة الزرد اليرقات في القرار الخلوية.

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

ووصف طريقة لphotoactivate الخلايا واحدة تحتوي على البروتين في قفص الفلورسنت باستخدام اثنين من الفوتون امتصاص من تي: الياقوت مذبذب يزر الفيمتو ثانية. إلى خريطة مصير الخلية photoactivated، يتم استخدام المناعية. ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى أي نوع من الخلايا.

واحدة رسم الخرائط ذات الصلة مصير الخليوي في الزرد

دالة فاصل الدهنية (FSL) يبني يسمح تعديل خصائص سطح الخلايا الحية وvirions دون فقدان للحيوية. الأسلوب يتطلب اتصال بسيط فقط من التوصل إلى حل بناء FSL مع خلية / الفيريون وعفوية ومستقرة التأسيس سطح يحدث.

FSL يبني : طريقة بسيطة لتعديل خلية / الفيريون السطوح مع مجموعة من العلامات البيولوجية دون أن يؤثر ذلك صلاحيتها

يمكن اتباعها لتطوير الزرد خلال الأيام مع المجهري ورقة الضوء عندما يتم تضمين الأجنة في أنابيب البوليمر واضحة بصريا مع منخفضة التركيز الاغاروز.

متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد

يمكن أن يلقي تصوير السلوك الديناميكي للعضيات والهياكل الخلوية الأخرى في الجسم الحي الضوء على وظيفتها في الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا ، نقدم طرقا لوضع علامات وراثية على عضيتين ، الجسيمات المركزية والميتوكوندريا ، وتصوير ديناميكياتها في أجنة الزرد الحية باستخدام الفحص المجهري واسع المجال ومتحد البؤر.

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

كان من الصعب نسبيا تحقيق التلاعب المستهدف لإحداث إجهاد موجه أو الموت في الخلايا الفردية. هنا ، يتم وصف نهج الاستئصال أحادي الخلية لإجهاد الخلايا الفردية وقتلها بشكل انتقائي في زراعة الخلايا الحية بناء على ليزر الأشعة فوق البنفسجية متحد البؤر القياسي.

أثار الإجهاد خلية والموت عن طريق التقليدية للأشعة فوق البنفسجية ليزر متحد البؤر المجهر

أهداب التنمية أمر حيوي ل organogenesis السليم. ويصف هذا البروتوكول أسلوب أمثل التسمية ووضع تصور لخلايا عضو من الزرد.

تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

الاستئصال بالليزر هو تقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة التجديد في النظم البيولوجية. يصف البروتوكول المعروض استخدام مجهر confocal المسح الضوئي بالليزر القياسي للاستئصال بالليزر والتصوير اللاحق للفاصل الزمني للخلايا المُتدرِّب في الخط الجانبي للحمار الوحشي.

الاستئصال الليزري القائم على المجهر والتجدد في خلايا الحمار الوحشي Interneuromast

هنا ، نقدم بروتوكولا لتسمية البروتينات بعلامة بروتين مضان في يرقات سمك الزرد ، وهو نظام تم تطويره وتعديله حديثا في الجسم الحي مفيد بشكل خاص لتصور البروتينات منخفضة الوفرة في أسماك الزرد.

وضع العلامات الفلورية لتصور البروتينات منخفضة التعبير في أسماك الزرد

تعلم تقنية الوسم النسبي للخلايا في أجنة أسماك الزرد باستخدام الفلوريسئين المحبوس والليزر فوق البنفسجي. تتيح هذه الطريقة تتبع مصير الخلايا المحددة عبر المجهر المناعي الضوئي.

الوسم نسب خلايا اسماك الزرد مع فلوريسئين الليزر ديكستران Uncagable

استكشف المزيد من الفيديوهات