تحريض مستضد خيفي محددة استعطال الإنسان في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى التي تحفيز مستضد خيفي مع حصار العلامة المشارك تنشيطية

الهدف العام من التجربة التالية هو تنشيط الخلايا التائية المانحة ذات الخصوصية الخيفية للمستقبل عن طريق التحفيز خارج الجسم الحي باستخدام المستضدات الخيفية للمستقبل، وذلك في وجود أجسام مضادة تمنع التحفيز المشترك للخلايا التائية بواسطة الخلايا المقدمة للمستضد عبر مستقبلات CD 28 الخاصة بها. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال عزل PBMC من مانحين صحيين مختلفين. بعد ذلك، يتم إعداد مزرعة مشتركة لتنشيط الخيفية عن طريق تحضين مجموعات PBMC غير المتطابقة من حيث HLA في وجود أجسام مضادة أحادية النسيلة للربيطات B 7.1 و B 7.2 لمنع تحفيز CD 28.

بعد ذلك، يتم قياس فعالية التنشيط الخيفي عن طريق تفاعلات اللمفاويات المختلطة الأولية والثانوية أو MLR. وأخيراً، يتم قياس الخصوصية الخيفية للتنشيط الخيفي من خلال تحديد الاستجابات الخاصة بطرف ثالث والاستجابات الخاصة بـ CMV. وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها أن الخلايا التائية للمانح تصبح منخفضة الاستجابة للتحفيز المستضدي الخيفي اللاحق، بينما تظل الخلايا التائية للمانح غير المتفاعلة خيفياً سليمة وفعالة.

لقد وظفنا هذه الاستراتيجية بنجاح في تجارب سريرية رائدة سابقة ومستمرة لنقل خلايا T من متبرع منشطة خيفياً أثناء وبعد زراعة الخلايا الجذعية غير المتطابقة من حيث مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA)، ولاحظنا تحسناً في إعادة تشكيل المناعة وانخفاضاً في عدد الإصابات بالعدوى وشدة مرض الطعم ضد المضيف الحاد والمزمن مقارنة بما لوحظ في المجموعات الضابطة التاريخية من متلقي عمليات زراعة غير متطابقة HLA دون معالجة. تكمن الميزة الرئيسية لاستراتيجية التنشيط الخيفي في تقليل التأثيرات خارج الهدف إلى أدنى حد، حيث إن هذه التقنية لا تقلل من استجابات خلايا T النوعية لمسببات الأمراض أو النوعية للمستضدات المرتبطة بالأورام، ولا تقضي على خلايا T التنظيمية CD4 من مجموعة خلايا T الخاصة بالمتبرع. ستقوم كريستين فين، وهي عالمة بحثية في مختبرنا، بتوضيح هذا الإجراء. تتمثل الخطوة الأولى في سحب الدم من اثنين من المتبرعين المتطوعين الأصحاء.

ستعمل الخلايا المأخوذة من متبرع واحد كخلايا مستجيبة، بينما تعمل الخلايا المأخوذة من متبرع آخر كخلايا محفزة. بعد ذلك، يتم عزل خلايا PBMC من الدم عن طريق الطرد المركزي بالتدرج الكثافي باستخدام fial pac. ثم يتم صبغ كمية صغيرة من الخلايا بـ trian blue وعد خلايا PBMC الحية باستخدام hemo cytometer reus.

قم بتعليق خلايا PBMC من كل متبرع في 10 milliliters من وسط استزراع مكتمل بتركيز 1 مليون خلية حية لكل milliliter في أنابيب مخروطية منفصلة سعة 15 milliliter. قم بتعيين أنبوبة واحدة من خلايا PBMC الخاصة بالمتبرع كمحفزات والأنبوبة الأخرى كمستجيبات لإعداد المزرعة المشتركة لتنشيط التمنيع الخيفي (allo energizing co-culture) بكميات كبيرة.

أضف 100 micrograms من الأجسام المضادة anti B 7.1 و anti B 7.2 إلى أنبوب سعة 15 milliliter المخصص للمحفز. رج الأنبوب بلطف ثم حضنه لمدة 30 minutes. وبعد انتهاء فترة الحضن، قم بتشعيع خلايا PBMC المحفزة وأضفها إلى قارورة زراعة خلايا T 25 سعة 50 cubic centimeter ذات غطاء نفاذ للغازات.

ضع ملصقاً على الدورق باسم "allo coal culture bulk". بعد ذلك، أضف 10 milliliters من خلايا PBMC المستجيبة من المتبرع الآخر بتركيز 1 million per milliliter في وسط غذائي كامل إلى الدورق. أضف 100 micrograms إضافية من كل من الأجسام المضادة antib 7.1 وAntib 7.2 إلى الدورق، ثم اخلط المكونات برفق قبل وضع الدورق في وضع عمودي داخل الحاضنة لمدة 72 hours.

بعد ذلك، قم بتعريض 10 ملايين أخرى من خلايا PBMC المحفزة للإشعاع لعمل مستنبت مشترك كعينة ضابطة شاملة بدون استخدام أجسام مضادة حاجزة، ثم أضفها إلى قارورة زراعة خلايا T 25 بسعة 50 cubic centimeter. ضع ملصقاً على القارورة بعنوان "مستنبت مشترك ضابط شامل". أضف 10 milliliters من نفس خلايا PBMC المستجيبة المستخدمة في المستنبت المشترك للتنشيط الخيفي الشامل بتركيز 1 مليون لكل milliliter في وسط غذائي كامل إلى القارورة، وامزجها بلطف قبل وضع القارورة في وضع عمودي داخل الحاضنة لمدة 72 ساعة.

تتمثل الخطوة التالية في قياس وظيفة مجموعة الخلايا التائية المانحة التي تم تنشيطها خيفياً في نفس اليوم الذي يتم فيه تحضير المزارع الجماعية؛ قم بتسمية طبق 96 بئراً بقاع على شكل U كـ primary MLR لكل نقطة زمنية من النقاط الثلاث المراد قياسها. بعد ذلك، قم بسكب 5 mL من كل من المزارع الجماعية الضابطة ومزارع التنشيط الخيفي المشتركة في أنابيب سعة 15 mL.

بعد ذلك، انقل بواسطة الماصة 200 µL من معلق الخلايا من كل أنبوب إلى آبار مكررة ثلاث مرات في كل لوحة من اللوحات الثلاث. قم بتمييز هذه الآبار بعبارة "بدون حصر التحفيز المشترك" أو "no CSB" للخلايا المستمدة من مزارع الضبط الشاملة الباردة، وعبارة "CSB" للخلايا المستمدة من مزارع التحفيز الخيفي الشاملة الباردة. ثم أضف 200 µL من الوسط الغذائي الكامل إلى ستة آبار في كل لوحة كضوابط سلبية.

أخيراً، أضف 200 µL من PBS إلى جميع الآبار الفارغة لتقليل التبخر، وضع الأطباق في الحاضنة لمدة 72 ساعة بعد إعداد المزارع المشتركة الكلية. قم بتسمية طبق UBO ذو 96 بئراً بأنه "secondary MLR" لكل نقطة زمنية من النقاط الزمنية الثلاث المراد قياسها. ولتحضير الخلايا المستجيبة لاختبار secondary MLR، انقل 5 mL من كل من المزارع المشتركة الضابطة (bulk control) والمحفزة خيفياً (allo energizing) إلى أنابيب سعة 15 mL، ثم قم بطرد مركزي للأنابيب لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق بسرعة 2000 RPM في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الخلايا مرتين إضافيتين عن طريق شفط SNAs بعناية، وتفكيك الكريات المترسبة، وإضافة 10 mL من الوسط الغذائي الكامل (complete media) إلى كل أنبوب، ثم قم بطرد مركزي للخلايا مرة أخرى بعد الغسلة الثانية.

أعد تعليق الخلايا في 1 mL من الوسط الغذائي الكامل. استخدم صبغ tripan blue لتعداد الخلايا الحية وضبط تركيز الخلايا ليصل إلى 1 مليون من الخلايا المستجيبة الحية لكل mL. انقل بواسطة الماصة 100 µL من معلق الخلايا من كل أنبوب إلى آبار مكررة ثلاث مرات في كل طبق.

قم بتسمية هذه الآبار أولاً "طرف أول" أو "تحفيز سبيكة FP". ثم انقل بواسطة الماصة 100 µL من معلق الخلايا من كل أنبوب إلى ثلاثة آبار أخرى في كل طبق، وقم بتسمية هذه الآبار "تحفيز CD 3/28 لـ PBMC من نفس المتبرع المستخدم لتوفير PBMC المحفز للطرف الأول من أجل التآكل". تُستخدم المزارع المشتركة المنشطة والضابطة كخلايا محفزة لـ MLR الثانوي؛ قم بتعليق 10 million من PBMC المتبرع الطرف الأول بتركيز 1 million/mL وقم بتشعيعها ثم إضافتها.

أضف 100 µL من الخلايا المحفزة المشععة إلى الآبار المسمى fp allo restimulation في كل لوحة MLR ثانوية. وبالنسبة للضوابط الموجبة، أضف 1 µL من كل من الأجسام المضادة أحادية النسيلة CD3 وCD28 و98 µL من الوسط الغذائي الكامل إلى الآبار المسمى CD 3 28 stimulation في كل لوحة MLR ثانوية. بالإضافة إلى ذلك، أضف 200 µL من الوسط الغذائي الكامل إلى ستة آبار فارغة في كل لوحة لتكون بمثابة ضوابط سالبة، وأضف 200 µL من PBS إلى جميع الآبار الفارغة للحد من التبخر.

ضع الأطباق في الحاضنة. تتمثل الخطوة التالية في قياس خصوصية الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) الخيفية المعزولة من متبرع سليم جديد يُسمى المتبرع الطرف الثالث، حيث تُستخدم لاختبار خصوصية العملية الخيفية في تفاعل مختلط من اللمفاويات (MLR) ثانوي. قم بتعليق خلايا PBMC الخاصة بالطرف الثالث بتركيز 1 million cells per milliliter، ثم قم بتشعيعها وتسمية ثلاثة أطباق من فئة 96 بعبارة "secondary MLR specificity day three, five and seven".

لتحضير الخلايا المستجيبة لتفاعل المختبر المختلط (MLR) الثانوي لقياس النوعية، انقل خمسة ملليلتر من كل من المزارع المشتركة الضابطة والمزارع المشتركة المنشطة خيفياً إلى أنابيب سعة 15 ملليلتر، ثم قم بطرد الأنابيب مركزياً لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق بسرعة 2000 RPM. بعد ذلك، اغسل الخلايا مرتين عن طريق سحب السوائل الطافية بعناية، وتفكيك الرواسب، وإضافة 10 ملليلتر من الوسط الغذائي الكامل إلى كل أنبوب، ثم طرد الخلايا مركزياً مرة أخرى بعد الغسلة الثانية. أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط الغذائي الكامل.

استخدم صبغة tiran blue لعد الخلايا وضبط تركيزها ليكون مليون خلية مستجيبة حية لكل مليلتر، ثم انقل بواسطة الماصة 100 µL من معلق الخلايا من كل أنبوب إلى آبار مكررة ثلاث مرات في كل طبق. ضع علامة TP أو تحفيز allo من طرف ثالث على هذه الآبار. بعد ذلك، أضف 100 µL من خلايا TP المحفزة المشععة إلى الآبار التي تحمل علامة TP allo stimulation.

لاختبار نوعية الاستجابات الخيفية بشكل أكبر، يتم قياس الاستجابة لمسببات الأمراض بعد تنشيط خلايا PBMC من متبرعين لديهم استجابات تكاثرية مثبتة مسبقاً لـ CMV. يتم تسمية الأطباق بـ label 3 96. أطباق Well plates ثانوية M-L-R-C-M-V في الأيام الثالث والخامس والسابع، ويتم نقل 5 milliliters من كل من مجموعة التحكم المجمعة ومزارع التنشيط الخيفية إلى أنابيب سعة 15 milliliter. بعد ذلك، يتم غسل الخلايا وعدّها وإعادة تعليقها بتركيز 1 million per milliliter في وسط غذائي كامل، ثم تُنقل بواسطة الماصة كمية 100 microliters من معلق الخلايا من كل أنبوب إلى ثلاث آبار في كل طبق، وتُسمى هذه الآبار CMV stimulation.

ثم أضف 0.1 µL من محلول CMV المفتت في 100 µL من الوسط الغذائي الكامل إلى الآبار المحددة باسم CMV stimulation. بعد ذلك، أضف 200 µL من الوسط الغذائي الكامل إلى ستة آبار في كل طبق كضوابط سلبية. وأخيرًا، أضف 200 µL من PBS إلى جميع الآبار الفارغة لتقليل التبخر، ثم ضع الأطباق في الحاضنة لقياس التكاثر في تفاعل MLR الأولي والثانوي.

أضف 1 µCi من الثيميدين المسمى بالتريتيوم إلى عينة الضبط السالبة والآبار التي تحتوي على الخلايا قبل 16 ساعة من حصاد الأطباق. قم بجمع الثيميدين على حصيرة ترشيح واحدة لكل طبق باستخدام جهاز TomTec harvester أو جهاز مشابه. جفف حصائر الترشيح لمدة ساعة واحدة.

ثم ضعها في أكياس عينات فردية. أضف 5 mL من سائل الوميض إلى كل منها وأحكم إغلاقها. قم بقياس دمج tri thymidine خلال آخر 16 ساعة من التجربة عن طريق قراءة مفارش الترشيح باستخدام عداد والاش للوميض البيتا الدقيق (wallach micro beta scintillation counter)، أو جهاز مشابه باستخدام خلايا PBMC محفزة ومستجيبة ذات عدم تطابق في HLA.

يمكن ملاحظة أن وجود حصار التحفيز المشترك في تفاعل اللمفاويات المختلط (MLR) الأولي يقلل من متوسط تكاثر الخلايا المناعية للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) المستجيبة في اليوم الخامس إلى حوالي 30% مما لوحظ في تفاعل اللمفاويات المختلط (MLR) الأولي الضابط في غياب حصار التحفيز المشترك. وهذا يعادل تثبيطاً متوسطاً للتكاثر الأولي للخلايا المناعية بنسبة حوالي 70% في اليوم الخامس، كما هو موضح في هذا الشكل.

يمكن ملاحظة أنه في تفاعل اللمفاويات المختلطة (MLR) الثانوي، تكون تكاثر الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) المنشطة خيفياً تجاه الطرف الأول عادةً بنسبة 10 إلى 15% مما لوحظ مع خلايا PBMC الضابطة في اليوم الخامس. وهذا يعادل متوسط تثبيط للتكاثر بنسبة 85 إلى 90%، مما يثبت أن خلايا PBMC المنشطة خيفياً تكون منخفضة الاستجابة للمحفزات الخيفية للطرف الأول. وكما يظهر في هذا الشكل، يمكن إعداد المزارع المشتركة الكلية المتطورة لخلايا الدم المحيطي أحادية النواة للمانح المنشطة خيفياً في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات.

يمكن توحيد هذا النهج بسهولة للاستخدام السريري لإنتاج خلايا T من المانح تتميز بانخفاض التفاعلية الخيفية، مع الاحتفاظ بالمناعة النوعية لمسببات الأمراض. ويمكن نقل هذه الخلايا تبنيًا في سياق زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم الخيفية لتحسين إعادة بناء الجهاز المناعي دون حدوث مرض طعم ضد المضيف مفرط. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر العمل بسرعة.

يساعد هذا في الحفاظ على حيوية الخلايا وتجنب التنشيط غير النوعي أو فقدان الخلايا المقدمة للمستضد. وفي حال استخدام خلايا PBMC المحفوظة بالتبريد للمحفزات أو المستجيبين، يجب اتباع بروتوكول معتمد لإعادة تنشيط الخلايا المجمدة يضمن الحصول على عوائد عالية ومستمرة من الخلايا الحيوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء عملية allo anize للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي من متبرع بشري، وكيفية إجراء المقايسات لتقييم فعالية ونوعية هذا الإجراء؛ حيث يمكن استخدام هذه الاستراتيجية لتوليد خلايا T من متبرع بشري ذات استجابات allo منخفضة، والتي يمكن استخدامها سريريًا لتحسين إعادة تشكيل الجهاز المناعي بعد زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم الخيفية.