اللوحة الصلبة المستندة إلى تقييد الغذائية في انواع معينة ايليجانس

الإجراء بتقييد غذائي على الصفيحة القياسية في أناقة البحر لدراسة تأثيرها على طول العمر والتكاثر والتمثيل الغذائي. يتم تحقيق ذلك عن طريق القياس الدقيق لتركيز البكتيريا التي سيتم استخدامها كمصدر للغذاء أولا. الخطوة الثانية من الإجراء هي تخفيف ثقافة البكتيريا بشكل صحيح إلى تركيزات مناسبة.

ثم قم بإعداد لوحات SDR ذات البكتيريا المقتولة. أخيرا ، قم بإعداد تجارب حقوق السحب الخاصة مع مجموعة متزامنة من الديدان. يمكن أن تظهر نتائج إنتاج النسل وقياسات العمر الافتراضي تأخر إنتاج النسل وانخفاضه بالإضافة إلى زيادة متوسط العمر.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على أكثر من 60 طريقة مثل Dian في وسط AZA ، هي أن جميع التجارب ستتم على مسرحية قياسية صلبة تعتمد على AGA والتي تستخدمها معظم المختبرات الدافئة لتجارب تقييد النظام الغذائي ورؤية الأناقة إنشاء منحنيات معايرة منفصلة لكل سلالة بكتيريا تستخدم كمصدر للغذاء. اختر مستعمرة واحدة من بكتيريا الإشريكية القولونية OP 50 من خط جديد على رطل أجار وقم بتلقيح ثلاثة ملليلتر من ثقافة المرق السائلة في شاكر 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قم بإعداد التخفيف التسلسلي المزدوج للثقافة الليلية.

ثم قم بقياس امتصاص كل تخفيف عند 600 نانومتر بواسطة مقياس الطيف الضوئي بثلاث نسخ. مزيد من التقليل من كل معلق بكتيري ، 1 مليون أضعاف بالتساوي بذر 0.4 مل من التعليق البكتيري لكل تخفيف على صفيحة زراعية 100 ملم رطل وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 18 إلى 24 ساعة. احسب عدد المستعمرات البكتيرية المزروعة في كل صفيحة لحساب وحدات تكوين المستعمرة لكل مليلتر لكل عينة.

الآن رسم OD 600 كدالة لتركيز البكتيريا وإجراء تحليل انحدار خطي لتأسيس العلاقة بين قيم OD 600 المقاسة وتركيزات البكتيريا OP 50. لهذه الطريقة ، يتم استخدام تركيز البكتيريا من واحد في 10 إلى 11 CFUs لكل مليلتر في حالة تغذية الادليدو ومرة واحدة 10 إلى الثامن CFU لكل مليلتر كحالة تغذية DR المثلى. ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى أربعة إلى ستة تركيزات مختلفة للبكتيريا لإنشاء علاقة تعتمد على الجرعة الكاملة.

من أجل حقوق السحب الخاصة واستجاباتها. تحضير لقاح بمستعمرة واحدة من بكتيريا الإشريكية القولونية OP 50 في ثلاثة ملليلتر من مرق LB السائل ، المزروع في شاكر 37 درجة مئوية لمدة ست إلى ثماني ساعات. انقل ثقافة OP 50 إلى قارورة جديدة تحتوي على 500 مل من مرق LB وتنمو بين عشية وضحاها حتى تصل البكتيريا إلى التشبع إذا لزم الأمر.

إعداد التخفيف المناسب لمزرعة OP 50 لقياس الامتصاص عند OD 600. لتحديد تركيز البكتيريا ، قم بتقطيع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 1500 Gs لمدة 20 دقيقة. إزالة المادة الطافية وإعادة تعليق البكتيريا إلى تركيز واحد في 10 في 12 CFUs لكل مليلتر.

الآن ، قم بإعداد 10 مليلتر من مزارع البكتيريا بستة تركيزات مختلفة ، تتراوح من واحد في 10 من 12 إلى 1 في 10 من CFU السابع لكل ماصة مليلتر. أشر ملليلترين من زراعة البكتيريا في وسط صفيحة N GM صلبة مقاس 60 ملم. تجنب لمس سطح اللوحة بطرف الماصة لأن الشقوق الموجودة على السطح تسمح للديدان بالحفر في التهوية.

ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم ضع 10 ميكرولتر من 100 ملليغرام لكل مليلتر من الكربونيك سوين و 10 ميكرولترات من 50 ملليغرام لكل مليلتر يمكن أن يكون مايسين على كل صفيحة لنمو البكتيريا الراحة. تخزين الأطباق التي تحتوي على تركيزات مختلفة من المضادات الحيوية البكتيريا المقتولة عند أربع درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل لمدة تصل إلى شهر واحد.

المهم تحضير وتخزين ما يكفي من الأطباق ، ويفضل أن تكون نفس الدفعة للمصنع بأكمله. جرب قبل يوم إلى يومين على الأقل للتحقق من صلاحية البكتيريا. اكشط بعض البكتيريا من ألواح SDR وانشرها على صفيحة N GM فارغة مع الكربونيك والشباك ومضادات المايسين.

ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ست إلى ثماني ساعات وتأكد من عدم وجود نمو بكتيري. بالنسبة لمعظم الدراسات المتعلقة بحقوق السحب الخاصة ، مثل تحليل العمر الافتراضي وتوصيف إنتاج النسل ، يعد إعداد مجموعة متزامنة من الديدان أمرا ضروريا. استخدم منتقي الدودة البلاتينية لنقل 20 إلى 30 من البالغين النشطين تكاثريا إلى العديد من أطباق NGM العادية.

مع OP 50. اعتمادا على عدد البويضات المطلوبة للتجارب ، قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من البالغين. اترك الأطباق على حرارة 20 درجة مئوية لمدة أربع ساعات للسماح بوضع البيض.

أخرج البالغين من الطبق وافحص الأطباق بصريا بحثا عن البيض. استمر في احتضان الصفائح عند 20 درجة مئوية للسماح للنسل بالتطور إلى مرحلة البلوغ المتأخرة من أربعة أيام واحدة. عادة ما يستغرق هذا ثلاثة أيام لدودان من النوع البري عند 20 درجة مئوية.

لتحليل العمر الافتراضي. انقل من 10 إلى 12 يوما من الديدان البالغة إلى لوحة SDR لبدء التقييد الغذائي. للحصول على قوة إحصائية كافية ، استخدم ما مجموعه 60 إلى 100 دودة لكل حالة من شروط حقوق السحب الخاصة.

سجل صلاحية كل دودة كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تموت جميع الديدان. الأهم من ذلك ، انقل الديدان إلى ألواح SDR جديدة كل يومين لتجنب المجاعة. يرسم منحنى المعايرة هذا تركيز OP 50 فيما يتعلق ب OD 600.

يمكن استخدام المعادلة الناتجة عن تحليل الانحدار الخطي لجميع الحسابات المستقبلية لتركيزات بكتيريا OP 50. تفحص هذه الدراسة تأثير علاجات حقوق السحب الخاصة المزمنة على متوسط العمر الافتراضي لسلالات الديدان المختلفة مقارنة بالاستجابة المعتمدة على الجرعة الطبيعية للديدان البرية لحقوق السحب الخاصة. يتم قمع تأثير العمر الافتراضي لحقوق السحب الخاصة جزئيا عن طريق الإفراط في التعبير عن DR ، بينما لا يوجد تأثير على طفرة DAF 16 MU 86 على إطالة العمر الناجم عن حقوق السحب الخاصة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء Dian على اللعب القياسي القائم على AGA في أناقة البحر.