غير الجراحية التقطير داخل الرغامى من الفئران مع تحليل الرئتين والعقد الليمفاوية والرئة التي تصريف التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو حقن مادة اختبار في رئتي الفئران بطريقة غير جراحية باستخدام إبرة تغذية أنبوبية، ومن ثم تحليل الرئتين والعقد الليمفاوية الصارفة للرئة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إدخال منظار حنجري مضيء وإبرة تغذية أنبوبية منحنية في القصبة الهوائية لفأر تحت التخدير. بعد ذلك، يتم غرس مادة الاختبار في رئتي الحيوان عبر المنظار الحنجري وإبرة التغذية الأنبوبية.

بعد ذلك، يتم استخراج الرئتين والعقد الليمفاوية المصرفة. وأخيراً، يتم معالجة الرئتين والعقد الليمفاوية لتحويلها إلى معلقات من الخلايا المفردة. وفي النهاية، تسهل هذه الطريقة تحليل قياس التدفق الخلوي لارتباط المادة المختبرة بالخلايا المناعية في الرئة، وهجرة هذه الخلايا إلى العقد الليمفاوية المصرفة من الرئة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل التعرض عن طريق الأنف أو الرذاذ، في أنها تسمح بتوصيل المادة المختبرة بشكل موجه إلى الرئتين مع تجاوز الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالأنف. بالإضافة إلى ذلك، فإنها بسيطة التنفيذ مقارنة بالتدخلات الجراحية في الجرذان من أجل الغرسه الرغامية. ستقوم بشرح هذا الإجراء إليزابيث إنتي، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبر ريتشي، ومانجي، طالبة دراسات عليا في مختبر لينس.

بعد تخدير الفأر، قم بتحضير اللقاح في 50 µL من المحلول الملحي. املأ محقنة سعة 1 mL مزودة بإبرة تغذية أنبوبية معقوفة ومعقمة باللقاح. اشحن المحقنة بجيب هوائي سعة 100 µL خلف اللقاح لضمان حقن كامل السائل في الرئة.

ضع الفأر على المنصة الخشبية المائلة بحيث يكون معلقاً من قواطعه على السلك، ثم ثبته في مكانه برفق باستخدام قطعة من الشريط. بعد ذلك، قم بتشغيل منظار الحنجرة بيد واحدة واستخدم اليد الأخرى للإمساك بزوج من الملاقط غير الحادة. استخدم طرف منظار الحنجرة والملاقط لفتح الفم برفق بواسطة الملاقط.

اسحب اللسان للخارج وثبته إلى الجانب. وجه نصل منظار الحنجرة نحو الجزء الخلفي من الفم. حافظ على ضغط منظار الحنجرة لأسفل برفق شديد بزاوية 90 درجة حتى تظهر فتحة القصبة الهوائية.

بينما يتم تثبيت منظار الحنجرة في مكانه بيد واحدة، أمسك بالسرنجة سعة 1 mL المزودة بإبرة تغذية أنبوبية منحنية تحتوي على اللقاح باليد الأخرى. أدخل الإبرة في القصبة الهوائية حتى تصبح الثنية الموجودة في الإبرة بمحاذاة القواطع الأمامية. ادفع المكبس بشكل متساوٍ لحقن اللقاح دون تكوين فقاعات.

اسحب الإبرة من الرغامي في أسرع وقت ممكن. أمسك الفأر في وضع عمودي لبضع ثوانٍ للسماح باستنشاق اللقاح إلى الرئتين. ضع الفأر بالقرب من مصباح تدفئة واتركه حتى يستيقظ.

بعد القتل الرحيم، قم بتثبيت أذرع وأرجل الفأر على لوحة التشريح. قم بعمل شق بالمقص على طول منتصف الجانب البطني. اسحب الجلد برفق لإظهار الصفاق.

أجرِ شقوقاً في البريتون لكشف الأعضاء البطنية. أمسك طرف القص بالملقط واثقب الحجاب الحاجز بالمقص. اقطع الحجاب الحاجز على طول جانبي القفص الصدري بحيث يكون المقص موازياً لسطح لوحة التشريح.

قم بالقطع عبر التجويف الصدري على طول الخط الظهري البطني من كلا الجانبين قليلاً. ارفع القفص الصدري في الجانب الأيمن من القلب. ابحث عن عقدتين لمفاويتين أسفل الغدة الزعترية مباشرةً.

تقع عقدة لمفاوية ثالثة أكبر قليلاً تحت وعاء دموي شرياني صغير يمتد بشكل عمودي على الرغامي. اجمع العقد اللمفاوية في واحد ملليلتر من محلول هضم العقد اللمفاوية، ثم اخلطها وضعها على الثلج. بعد جمع العقد اللمفاوية، اجمع الرئتين في طبق ذو ستة آبار.

مع الحفاظ على الطبق ذو الستة آبار على الثلج، قم بشفط محلول PBS وقطع الفصوص إلى قطع صغيرة باستخدام الملاقط والمقص. ثبّت كل عقدة لمفاوية باستخدام إبرة قياس 26، ثم قم بتفكيكها باستخدام إبرة ثانية قياس 26. ولضمان تحرر جميع الخلايا، أضف 3 mL من مزيج الهضم الخاص بالرئتين و 1 mL للعقد اللمفاوية.

بعد تحضين العقد اللمفاوية لمدة تتراوح من 25 إلى 30 دقيقة، والرئتين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، أضف EDTA بتركيز نهائي قدره 10 millimolar إلى كل خليط من خلطات الهضم لإيقاف التفاعل، ثم ضعها على الثلج. وباستخدام محقنة سعة ثلاث ملليمتر، مرر قطع الرئتين عبر إبرة مقاس 18 gauge. قم بهرس قطع الرئتين والعقد اللمفاوية ثلاث مرات عبر مصافٍ خلوية بفتحات تتراوح من 70 إلى 100 micron.

باستخدام الطرف الخلفي لمكبس محقنة سعة 1 مل، اغسل مصفاة الخلايا بـ 10 مل من HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. قم بطرد عينات الخلايا مركزياً عند 500 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. أعد تعليق الراسب في 5 مل من محلول تحلل كريات الدم الحمراء، ثم حضنها لمدة ثلاث دقائق.

في درجة حرارة الغرفة، أضف 10 milliliters من HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم لإيقاف عملية التحلل، ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 500 ×g لمدة خمس دقائق. أكمل حجم معلقات الخلايا المفردة للرئة والعقد اللمفاوية التصريفية للرئة إلى 10 milliliters و5 milliliters على التوالي. استخدم صبغة tripan blue في مقياس الكريات hemo cytometer لعد الخلايا.

في هذين الشكلين، تم تعريض فئران AJ لجرعة مقدارها 1×10⁸ من أبواغ basillas rassis، وتم تحليل الرئتين بواسطة قياس التدفق الخلوي بعد 30 دقيقة من العدوى. توضح هذه المخططات النقطية استراتيجية تحديد البوابات (gating strategy). وتظهر هذه اللوحات النسبة المئوية لخلايا الرئة الموجبة لـ CD 45 وCD 11 C والتي تكون موجبة لأبواغ bacillus anthrax.

في هذا الشكل، حُقنت فئران من سلالة AJ عن طريق الرغامي، ومن ثم تم تحليل العقد اللمفاوية المصرّفة للرئة. تُظهر مخططات النقاط التمثيلية النسبة المئوية لخلايا CD 11 C high في العقد اللمفاوية المصرّفة للرئة التي تحتوي على حبيبات فلورية مرسومة مقابل قناة فارغة. يُظهر اللوح الأيسر النتائج من الفئران التي حُقنت بمحلول PBS، بينما يُظهر اللوح الأيمن النتائج من الفئران التي حُقنت بـ 5 × 10⁹ من الكرات المجهرية ذات اللون الأصفر الأخضر الساطع مع 10 µg من LPS.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في هذا المجال، مثل ماهية الأحداث التي تبدأ تحديداً في الرئتين، وكيفية انتقال المستضدات المستنشقة من الرئتين إلى العقد اللمفاوية التصريفية.