غير الجراحية التقطير داخل الرغامى من الفئران مع تحليل الرئتين والعقد الليمفاوية والرئة التي تصريف التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو اختبار المواد غير جراحية في رئتي الفئران باستخدام إبرة تزقيم وتحليل الرئتين والرئة التي تستنزف الغدد الليمفاوية لاحقا. يتم تحقيق ذلك عن طريق إدخال منظار الحنجرة المضيء وإبرة التزقيم المثنية أولا في القصبة الهوائية للفأر المخدر. ثم يتم غرس مادة الاختبار في رئتي عبر منظار الحنجرة وإبرة التزقيم.

بعد ذلك ، يتم استخراج الرئتين والغدد الليمفاوية المستنزفة. أخيرا ، تتم معالجة الرئتين والغدد الليمفاوية في معلقات خلية واحدة. في النهاية ، تسهل هذه الطريقة تحليل التدفق الخلوي لارتباط مادة الاختبار بالخلايا المناعية للرئة وتهريب الخلايا إلى الغدد الليمفاوية التي تستنزف الرئة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التعرض داخل الأنف والبخاخ ، هي أنها تسمح بالتوصيل المباشر لمادة الاختبار إلى الرئتين متجاوزة الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالأنف. بالإضافة إلى ذلك ، من السهل القيام به مقارنة بالفئران الجراحية في تركيب القصبة الهوائية. ستظهر الإجراء إليزابيث إنتي ، باحثة ما بعد الدكتوراه في مختبر ريتشي ، ومانجي ، طالبة دراسات عليا في مختبر العدسات.

بعد تخدير الفأر ، قم بإعداد اللقاح في 50 ميكرولتر من المحلول الملحي. املأ حقنة سعة مليلتر واحد مزودة بإبرة تزقيم مثنية معقمة باللقاح. قم بتحميل المحقنة بجيب هوائي سعة 100 ميكرولتر خلف اللقاح للتأكد من تركيب كل السائل في الرئة.

ضع الماوس على المنصة الخشبية المائلة المعلقة بقواطعها على السلك وقم بتقييده برفق في مكانه بقطعة من الشريط. بعد ذلك ، قم بتشغيل منظار الحنجرة بيد واحدة واستخدم اليد الأخرى للاستيلاء على زوج من الملقط غير الحاد. استخدم طرف منظار الحنجرة والملقط لفتح الفم برفق باستخدام الملقط.

اسحب اللسان للخارج وامسكه على الجانب. قم بتوجيه شفرة منظار الحنجرة باتجاه الجزء الخلفي من الفم. حافظ على ضغط منظار الحنجرة برفق شديد بزاوية 90 درجة حتى يمكن رؤية فتحة القصبة الهوائية.

أثناء تثبيت منظار الحنجرة في مكانه بيد واحدة ، خذ حقنة المليلتر المزودة بإبرة التزقيم المنحنية التي تحتوي على اللقاح باليد الأخرى. أدخل الإبرة في القصبة الهوائية حتى يكون الانحناء في الإبرة بواسطة القواطع الأمامية. ادفع المكبس بالتساوي لتوصيل اللقاح دون فقاعات.

اسحب الإبرة من القصبة الهوائية في أسرع وقت ممكن. أمسك الماوس في وضع مستقيم لبضع ثوان للسماح باستنشاق اللقاح في الرئتين. ضع الماوس بالقرب من مصباح التدفئة واتركه يستيقظ.

بعد القتل الرحيم ، قم بتثبيت ذراعي وأرجل الفأر على لوحة تشريح. قم بعمل شق على طول منتصف الجانب البطني بالمقص. اسحب الجلد برفق وكشف الصفاق.

قم بعمل شقوق في الصفاق لكشف أعضاء البطن. أمسك طرف القص بالملقط وثقب الحجاب الحاجز بالمقص. قم بقص الحجاب الحاجز على طول جانبي القفص الصدري بالمقص الموازي لسطح لوحة التشريح.

قطع التجويف الصدري على طول الظهرخط البطني على كلا الجانبين قليلا. ارفع القفص الصدري على الجانب الأيمن من القلب. تحت الغدة الصعترية مباشرة ابحث عن عقدتين ليمفاويتين.

عقدة ليمفاوية ثالثة أكبر قليلا أسفل وعاء دموي شرياني صغير يمتد بشكل عمودي على القصبة الهوائية. احصد الغدد الليمفاوية في مليلتر واحد من هضم العقدة الليمفاوية ، واخلطها وضعها على الثلج. بعد حصاد الغدد الليمفاوية ، قم بحصاد الرئتين في صفيحة من ستة آبار.

مع الحفاظ على صفيحة الآبار الستة على الجليد ، قم بشفط PBS وتقطيع الفصوص إلى قطع صغيرة باستخدام الملقط والمقص. أمسك كل عقدة ليمفاوية لأسفل بإبرة قياس 26 وقم بفصلها بإبرة ثانية قياس 26. لضمان إطلاق جميع الخلايا ، أضف ثلاثة ملليلتر من مزيج الهضم للرئتين ومليلتر واحد للغدد الليمفاوية.

بعد احتضان الغدد الليمفاوية لمدة 25 إلى 30 دقيقة ، والرئتين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، أضف EDTA إلى تركيز نهائي قدره 10 مللي مولار لكل من مخاليط الهضم لإيقاف التفاعل ثم ضعها على الجليد. باستخدام حقنة سعة ثلاثة ملليلتر ، مرر قطعا من الرئتين عبر إبرة قياس 18. اهرس قطع الرئتين والغدد الليمفاوية ثلاث مرات من خلال مصافي خلايا من 70 إلى 100 ميكرون.

باستخدام الطرف الخلفي لمكبس حقنة سعة مليلتر واحد ، اغسل مصافي الخلايا ب 10 مل من HBSS بدون جهاز طرد مركزي بالكالسيوم والمغنيسيوم. تأخذ الخلية عينات عند 500 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. يقوم ريس بثني الكريات في خمسة ملليلتر من تحلل خلايا الدم الحمراء ، والمخزن المؤقت ، واحتضانه لمدة ثلاث دقائق.

في درجة حرارة الغرفة ، أضف 10 مل من HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم لإخماد الطرد المركزي للتحلل العينات عند 500 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق. قم بإحضار الرئة والرئة لتصريف الغدد الليمفاوية ، ومعلقات الخلية المفردة إلى 10 ملليلتر وخمسة ملليلتر على التوالي. استخدم استبعاد التريام الأزرق في مقياس الخلوي الدموي لحساب الخلايا.

في هذين الرقمين ، تم تحدي فئران AJ مع واحد في 10 إلى ثامن جراثيم basillas rassis ، وتم تحليل الرئتين عن طريق قياس التدفق الخلوي في 30 دقيقة بعد الإصابة. تظهر هذه المخططات النقطية استراتيجية البوابات. توضح هذه اللوحات النسبة المئوية لخلايا الرئة الإيجابية CD 45 CD 11 C الإيجابية لجراثيم الجمرة الخبيثة العصية.

في هذا الشكل ، تم حقن الفئران AJ عن طريق القصبة الهوائية ثم تم تحليل الغدد الليمفاوية التي تستنزف الرئة. تظهر المخططات النقطية التمثيلية النسبة المئوية للخلايا العالية CD 11 C في الغدد الليمفاوية التي تستنزف الرئة والتي تحتوي على حبات فلورية مرسومة على قناة فارغة. تظهر اللوحة اليسرى نتائج من الفئران التي تم حقنها ب PBS ، وتظهر اللوحة اليمنى نتائج من الفئران التي تم حقنها بخمسة أضعاف 10 إلى النباتات التسعة ، وهي كريات مجهرية خضراء صفراء زاهية مع 10 ميكروغرامات من LPS.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في هذا المجال ، مثل الأحداث التي تبدأ على وجه التحديد في الرئتين ، وكيف يتم تهريب المستضدات المستنشقة إلى الغدد الليمفاوية المستنزفة من الرئتين.