سبع خطوات لخلايا النجمية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا النجمية الكبدية من كبد الفأر. يتم تحقيق ذلك من خلال إجراء تروية لكبد الفأر أولاً باستخدام الإنزيمات الهاضمة. وبعد التروية، يتم تقطيع الكبد إلى قطع صغيرة لزيادة كفاءة عملية الهضم المختبرية التي تُجرى بعد ذلك.

كخطوة أخيرة، يتم فصل الخلايا النجمية الكبدية عن أنواع الخلايا الكبدية الأخرى بواسطة طرد مركزي بتدرج الكثافة. وفي نهاية المطاف، يتم الحصول على الخلايا النجمية الكبدية ويمكن تقييم نقائها بواسطة المجهر الضوئي والمجهر الفلوري المناعي. سيقوم باتريك ماير، وهو طالب دراسات عليا من المختبر، باستعراض هذا الإجراء. وتحضيراً لعملية تروية كبد الفئران NC two، قم أولاً بتدفئة محلول SC one المنظم ومحاليل تروية الإنزيمات في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C.

بعد ذلك، قم بضبط المضخة 연동ية (peristaltic pump) للحصول على تدفق صفائحي بمعدل 6.5 milliliters per minute، وقم بموازنة أنبوب السيليكون الخاص بالمضخة باستخدام محلول SC one. الآن، تأكد من أن الفأر المخدر في حالة تخدير عميق من خلال فقدان ردود الفعل المنعكسة. ثم قم بتثبيت الفأر في وضع الاستلقاء الظهري على قاعدة مناسبة.

استخدم المقص والملاقط لإجراء شق طولي في جلد البطن وكشف الصفاق. افتح الصفاق بعناية وانقل الأمعاء خارج تجويف البطن إلى الجانب الأيسر من الحيوان من أجل كشف الوريد البابي. إن الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو التروية الصفرية للكبد باستخدام الإنزيمات الهاضمة، وهو ما سيتم توضيحه.

بعد ذلك، من المهم استخدام مجهر ستيريو عند إدخال الكانيولا ومراقبة التغيرات في هياكل الكبد بدقة أثناء عملية التروية. وأثناء العمل تحت مجهر ستيريو، أدخل كانيولا مجموعة التسريب في الوريد البابي. ابدأ تروية الكبد باستخدام 30 milliliters من محلول SC one. افتح الوريد الأجوف السفلي فور بدء التدفق.

يُستدل على نجاح عملية غسل الكبد من خلال فقدان لون نسيج الكبد، بعد ذلك، يتم تروية الكبد بـ 30 milliliters من محلول Pronase E. سوف تتورم فصوص الكبد وستظهر الفصيصات واضحة من خلال الكبسولة بعد التروية بمحلول Pronase E، ثم تُروى بـ 30 milliliters من محلول collagenase P. وعند اكتمال التروية بـ collagenase P، يتم استئصال الكبد من الفأر عن طريق تشريحه بعناية وفصله عن الحجاب الحاجز والأعضاء المحيطة، ثم تخزينه في 70 milliliters من محلول SC two على الثلج.

يكون الكبد في هذه المرحلة قد فقد شكله ويبدو رخواً وغير متبلور. يجب تنفيذ إجراء هضم أكباد الفئران تحت ظروف معقمة، داخل خزانة تدفق صفائحي.

استخدم مقصاً حاداً لتقطيع الأكباد إلى قطع يبلغ حجمها ٢ × ٢ × ٢ مليمتر مكعب تقريباً. ثم اخلط معلق 70 milliliters من SC two وقطع الكبد مع 50 milliliters من محلول protease E collagenase P. أضف one milliliter من dna, one solution وقم بهضم الأكباد لمدة 20 minutes عند 37 °C مع التقليب.

بعد الهضم الإنزيمي لأنسجة الكبد، يتم فصل الخلايا النجمية عن أنواع الخلايا الكبدية الأخرى بواسطة عملية الطرد المركزي بالتدرج الكثافي. لبدء هذا الإجراء، يتم ترشيح معلق الخلايا عبر مصافٍ خلوية بقطر 70 ميكرومتر في ستة أنابيب فالكون سعة 50 ملليلتر، وتغسل الخلايا باستخدام محلول E two المنظم، ثم يتم إجراء الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 600 Gs ودرجة حرارة 4 درجات مئوية. وبعد الطرد المركزي، يتم سحب 40 ملليلتر من الرائق بعناية من كل أنبوب.

بعد ذلك، أضف 150 µL من محلول DNAs one إلى كل أنبوب وأعد تعليق الخلايا. اجمع معلقات الخلايا في أربعة أنابيب Falcon سعة 50 mL واغسلها باستخدام G-B-S-S-P عبر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 600 ×g ودرجة حرارة 4 °C. اشفط أكبر قدر ممكن من السائل الطافي بعناية دون تحريك الراسب، ثم أضف 150 µL من محلول DNAs one إلى كل أنبوب.

نقوم بتعليق رواسب الخلايا في 10 milliliters من G-B-S-S-B لكل أنبوب. تُجمع الخلايا في أنبوبين من نوع falcon سعة 50 milliliter، ويُضاف G-B-S-S-B حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 36 milliliters لكل أنبوب. يُضاف 14 milliliters من محلول den إلى كل أنبوب ويُخلط جيداً.

بعد ذلك، انقل 10 milliliters من معلق الخلايا إلى أنبوب واحد من أنابيب الطرد المركزي المتدرجة سعة 12 milliliter، بحيث يكون المجموع 10 أنابيب. أضف برفق 1.5 milliliters من G-B-S-S-B فوق معلق الخلايا في كل أنبوب. قم بإجراء الطرد المركزي للتدرجات لمدة 15 minutes عند 1500 Gs ودرجة حرارة أربع degrees Celsius دون توقف.

بعد ذلك، ستترسب الخلايا الكبدية في قاع الأنبوب، بينما توجد الخلايا النجمية في الواجهة البينية على شكل حلقة بيضاء. باستخدام ماصة سعة 5 milliliter، اسحب بعناية الواجهة البينية التي تحتوي على الخلايا النجمية وانقلها إلى أنبوب سعة 50 milliliter. اغسل الخلايا بإضافة G-B-S-S-B ثم قم بالطرد المركزي لمدة 10 minutes عند 600 Gs ودرجة حرارة 4 °C.

اشفط السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 20 milliliters من وسط DMEM مع المكملات. بعد عد الخلايا، انقلها إلى دوارق زراعة الأنسجة بتركيز 2 × 10⁴ خلية لكل سنتيمتر مربع، ثم قم بتحضين الخلايا عند 37 °C و5% CO2. بعد حوالي ساعتين من تحضيرها، يجب أن تكون الخلايا النجمية الكبدية ملتصقة، قم بتغيير الوسط لغسل الخلايا الميتة وحطام الخلايا.

أعد الخلايا إلى الحاضنة؛ وتظهر هنا النتائج النموذجية لتحضير الخلايا النجمية الكبدية من أكباد الفئران باستخدام هذا البروتوكول. تظهر الخلايا في اليوم الأول واليوم الثالث من المزرعة في المختبر المورفولوجيا المميزة للخلايا النجمية الكبدية، حيث تكون ذات شكل نجمي وتظهر تخزيناً للحويصلات الدهنية.

في المواقع النووية، يمكن أيضاً التحقق من نقاء الخلايا النجمية الكبدية المعزولة عن طريق تعبير البروتين الحمضي الليفي الدبقي أو GFAP. تُظهر هذه الصور صبغاً ممثلاً بالفلورة المناعية لـ GFAP باللون الأحمر في الخلايا النجمية الكبدية، والتي تم استزراعها لمدة ثلاثة أيام بعد عزل الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية عزل الخلايا النجمية الكبدية من كبد عصبون للحصول على عائد كافٍ من الخلايا النجمية النقية.

من المهم ضمان حدوث عملية هضم فعالة عند تروية الكبد. وأخيراً، من الضروري تحديد الهوية الصحيحة للخلايا المعزولة من خلال تقييم المورفولوجيا والنمط الظاهري لخلايا الكبد.