الميل عبر الغشاء Oligomerization المجال يحدده الفحص ToxR

الهدف العام من التجربة التالية هو التحقيق في ميول الأربطة للبروتين أو مجالات الغشاء أو T MDs في بيئة الغشاء الطبيعي. يتم تحقيق ذلك من خلال التعبير عن مجال الغشاء الذي يثير اهتمامه ب الإشريكية القولونية كبروتين خيميري مع بروتين ربط المالتوز للتوطين في محيط البلازما والسموم. R كمراسل نسخي ، يؤدي الرباط المستحث عن مجال الغشاء إلى تعتيم السموم R وتنشيط نسخ LXi كخطوة ثانية يتم تحلل الخلايا ومعالجتها باستخدام ONPG ، والذي يتم تحلله بواسطة بيتا جالاكتو إلى الأنواع الممتصة للضوء O نيترو فولات أو ONP.

بعد ذلك ، يتم قياس مستويات ONP عن طريق قياس امتصاص الضوء عند 405 نانومتر. من أجل تحديد مستويات مجال الغشاء ، تكشف نتائج الرباط عن ميل الرباط لمجالات الغشاء بناء على مقايسة مراسل السموم R. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الفيزيائية الحيوية الحالية مثل صفحة SDS أو التألق ، هي أن سلوك مجال الغشاء تتم دراسته في طبقة ثنائية الفوسفوليبيد الطبيعية عن طريق التعبير في الإشريكية القولونية بدلا من نظام محاكاة الغشاء مثل المنظفات.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البروتين الغشائي ، مثل توضيح السمات الهيكلية الرئيسية المتضمنة في جمعية اللولب عبر الغشاء قبل بدء هذا البروتوكول ، يتم تحضير سبعة بلازميدات للجدري تعبر عن البروتين الخيمري المطلوب من قليل النوكليوتيدات المركبة تجاريا ، والتي تمثل المواد الصلبة الذائبة ذات الأهمية التي يحيط بها NHE واحد و BMH واحد. مواقع التقييد بعد تحضير البلازميدات تذوب بلطف fhk 12 خلية مختصة على الجليد. بمجرد إذابتها ، نقل الخلايا إلى أنابيب زراعة سعة 15 مليلتر بمعدل 200 نانوجرام من كل حمض نووي للبلازما إلى أنبوب منفصل واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة.

ثم قم بصدمة الخلايا بالحرارة لمدة 90 ثانية عند 42 درجة مئوية ، متبوعا بالحضانة على الجليد لمدة دقيقتين عند 800 ميكرولتر من وسائط SOC واحتضان العينات عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة ساعة بعد الحضانة تلقيح خمسة ملليلتر من وسائط LB التي تحتوي على الكلورامفينيكول و aose ب 50 ميكرولتر من خليط التحويل باستخدام أنابيب استزراع 15 مل في ثلاث نسخ لكل عينة. أخيرا ، احتضان العينات عند 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 20 ساعة. لقياس كل أربطة المواد الصلبة الذائبة من بيتا galacto tase يتم تحديد نشاط.

أولا ، قم بتسخين قارئ اللوحة مسبقا إلى 28 درجة مئوية. أستذك مخزون المخزن المؤقت Z لإعداد حلول المخزن المؤقت Z الجديدة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. انقل الكلوروفورم العازل Z من الأنبوب إلى الخزان ، مع التأكد من توصيل الطبقة المائية العليا من الكلوروفورم العازل Z فقط.

ضع لوحة البئر 96 على قطعة من الورق مع شبكة مرسومة لضمان نقل دقيق سحب العينات 100 ميكرولتر من الكلوروفورم العازل Z إلى كل بئر من لوحة 96 بئر ، متبوعة بخمسة ميكرولترات من كل مزرعة في رباعي. مكرر حذف الثقافة من الآبار الأربعة التي ستكون بمثابة فراغات. قم بقياس OD 5 95 للوحة لتحديد كثافة الخلية.

أضف 50 ميكرولترا من Z buffer SDS إلى جميع آبار اللوحة. ثم هز اللوحة في قارئ اللوحة لمدة 10 دقائق لتجميع الخلايا بعد تحلل الخلية عند 50 ميكرولتر من ZPA ل ONPG لجميع الآبار. أعد اللوحة إلى قارئ اللوحة وقم بقياس OD 4 0 5 كل 30 ثانية لمدة 20 دقيقة.

حدد مستوى نشاط بيتا لاكتو ساسي من خلال حساب وحدات ميلر التي يتم تطبيعها إلى الفراغ. يتم إجراء النشاف الغربي للتحقق من تعبير البروتين المكافئ بين البنيات. أولا ، اجمع بين 50 ميكرولترا من الثقافات الثلاثية ثم قم بالطرد المركزي للعينات باستخدام جهاز طرد مركزي صغير.

قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينة وإعادة التغذية. قم بتعليق الحبيبات المتبقية في اثنين × تحميل عازل لتحميل العينة 7.5 ميكرولتر من كل عينة على هلام قياسي 8٪ وقم بإجراء الرحلان الكهربائي عند 125 فولت لمدة ساعة وخمس دقائق بعد النقل. احتضان الغشاء بجسم مضاد مترافق مضاد M-V-P-H-R-P لتصور البروتين الخيمري الذي لوحظ في حوالي 70 كيلودالتون مع بعض منتجات التحلل التي ترى أحيانا حوالي 48 كيلودالتون.

لوحظ MVP الذاتي أيضا عند 45 كيلو دالتون. من أجل تقييم الإدخال الصحيح للغشاء لبنية TMD الخيمرية ، يتم استخدام خط خلية PD 28 الذي يعاني من نقص بروتين ربط المالتوز عند زراعته في الحد الأدنى من الوسائط مع المالتوز كمصدر الكربون الوحيد ، يمكن فقط للخلايا التي تعبر عن منتج تعبير غشائي متكامل مع بروتين ربط المالتوز الموجود بشكل صحيح في البلازما المحيطة. قم بتحويل خلايا PD 28 كما هو موضح لخلايا fhk 12 وتلقيح ملليلترين من وسط LB.

قم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 300 دورة في الدقيقة طوال الليل بعد الحضانة. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسلها بواسطة تعليق Resus في ملليلترين من PBS وسحب لطيف بطرف كبير. بعد التكوير ، تغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام PBS للمرة الثانية ، ثم تقوم بإجراء طرد مركزي نهائي وتعليق إعادة التشكيل في مليلتر واحد من PBS.

استخدم 25 ميكرولترا من الخلايا المعلقة لتلقيح خمسة ملليلتر من الحد الأدنى من الوسائط. احتضان خلايا 37 درجة مئوية مع الاهتزاز في 15 ساعة. انقل 200 ميكرولتر من كل عينة إلى صفيحة 96 بئر ، وخذ قراءة OD 5 9 5 باستخدام قارئ اللوحة.

كرر هذه العملية كل ساعتين حتى 25 ساعة. تم تحليل ميل جميع الأربطة لمجالات الغشاء الفردية من البروتين الغشائي الكامن للغشاء الممتد عبر الغشاء الممتد باستخدام مقايسة مراسل النسخ ل tox R. يظهر المجال عبر الغشاء الخامس ميلا قويا لارتفاع الرابطة كما يتضح من وحدات ميلر العالية ، والتي يمكن مقارنتها بتسلسل التعتيم الراسخ GPAA للتحكم الإيجابي.

تقلل طفرة ضارة في مجال الغشاء خمسة D واحد 50 A من قدرة التسلسل على كل ارتفاع liga LMP واحد ، TM واحد لا يرتفع بشكل كبير في جميع الليجات ويعرض إشارة وحدة ميلر منخفضة جدا فوق إشارة فارغة ، وهي خلايا FHK 12 غير المحولة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد ما إذا كان حلزون الغشاء محل الاهتمام لديه القدرة على تكوين مجمعات عالية الترتيب في بيئة غشاء طبيعية أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم إدخال الماصة بعناية فائقة في لوحة البئر 96 لتجنب الأخطاء الكبيرة والتأكد من عدم إدخال فقاعات هواء.