توليد خلايا T - Multivirus محددة لمنع / علاج الالتهابات الفيروسية خيفي بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم

الهدف العام من الإجراء التالي هو التوليد السريع للخلايا التائية السامة للخلايا (CTLs) المتخصصة في الفيروسات والمشتقة من المتبرع، والتي تكون مناسبة للنقل التبني إلى متلقي زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدم الخيفية (HSCT). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق نقل البلازميدات التي تشفر المستضدات الفيروسية إلى الخلايا الشجيرية (dcs) لتهيئة هذه الخلايا لتقديم المستضد. وفي الخطوة الثانية، تُستخدم الخلايا الشجيرية التي تم نقل البلازميدات إليها لتحفيز الخلايا التائية النوعية للمستضد، والتي يتم توسيعها بعد ذلك في وجود IL-4 وIL-7 في جهاز استنبات نفاذ للغازات يسمى GASPAR.

بعد ذلك، وبعد سبعة أيام من الزراعة، يتم تقسيم الخلايا وإعادة توزيعها وتجديد أوساطها الغذائية من أجل الحفاظ على أقصى توسع للخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) في المختبر. وأخيراً، في اليوم 12، يتم حصاد الخلايا واختبار نقائها وفاعليتها وسلامتها، ثم يتم حفظها بالتبريد لاستخدامها سريرياً لاحقاً. وفي نهاية المطاف، يمكن توليد خطوط من الخلايا اللمفاوية التائية السامة للخلايا (CTL) ذات خصوصية متعددة الفيروسات وأدنى حد من التفاعل الخيفي، كما يتضح من صبغة السيتوكين داخل الخلايا، وإنتاج interferon gamma، والسمية الخلوية.

تعتبر عملية تصنيع خطوط الخلايا التائية السامة للخلايا والمحددة لأنواع متعددة من الفيروسات عملية مستهلكة للوقت ومجهدة، حيث تتطلب استخدام خطوط الخلايا البائية المحولة بفيروس Epstein-Barr وفيكتورات الفيروسات الغدانية، وتستغرق هذه الإجراءات حوالي ثلاثة أشهر. أما طريقتنا الجديدة فلا تستخدم الفيكتورات الفيروسية.

تنمو الخلايا بشكل أسي في المزرعة مع حد أدنى من فقدان الخلايا، وبالتالي فإن هذا الإجراء سريع وفعال من حيث التكلفة. تقوم يوريكا جيردمان، وهي زميلة إكلينيكية في المختبر، بتوضيح هذا الإجراء: قم بحصد الخلايا التغصنية (DCs) المشتقة من الخلايا الوحيدة، والتي تم إنتاجها في وسط Cellgenic المكمل بـ IL four و G-M-C-S-F، ثم نضجت لمدة 24 ساعة في سيتوكينات الإنضاج، وذلك عن طريق التعليق اللطيف باستخدام ماصة نقل سعة 3 milliliter. استخدم صبغة trian blue لعد الخلايا التغصنية، ثم انقلها إلى ثلاثة أنابيب سعة 15 milliliter، بحيث لا يقل عدد الخلايا عن 0.5 × 10⁶ ولا يزيد عن 2 × 10⁶ خلية لكل أنبوب.

بعد ذلك، قم بطرد مركزي لـ DCS لمدة 10 دقائق عند 200 ×g. وخلال هذا الوقت، قم بتحضير ستة ملليلتر من وسط cell genix مضاف إليه نفس مزيج السيتوكينات المسؤول عن نضج DC كما في السابق، ثم وزع ملليلترين في ثلاث آبار من طبق زراعة أنسجة مكون من 12 بئراً، واملأ الآبار غير المستخدمة بملليلترين من الماء المعقم. انقل الطبق إلى حاضنة عند 37 °C مع 5% CO2 للتدفئة المسبقة.

بمجرد انتهاء عملية طرد الخلايا مركزياً، يتم سحب السوائل الطافية وإضافة بلازميدات DNA ذات الصلة إلى كل أنبوب بتركيز نهائي قدره 5 µg من DNA لكل أنبوب. هنا، يتم إضافة البلازميد الذي يشفر IE one PP 65 إلى الأنبوب رقم واحد، وheon penton إلى الأنبوب رقم اثنين، و E BNA one LMP two BZ F1 إلى الأنبوب رقم ثلاثة reus. يتم تعليق الـ DCS والـ DNA باستخدام 100 µL من محلول النقل النووي.

امزج المكونات جيداً وانقل الخليط إلى كوفيتات NU nuclear affection. ضع الكوفيتات في جهاز four D nucleo effector. اختر البرنامج CB one 50 واضغط على زر البدء مباشرة بعد عملية nuclear affection.

أضف 500 µL من وسط نضج CELLGENIC DC المُدفأ مسبقاً إلى كل أنبوب من الخلايا الممزوجة عن طريق السحب والضخ بلطف بالماصة من مرتين إلى ثلاث مرات، ثم انقل خلايا الـ DCs المتأثرة بالنواة إلى طبق 12 فجوة المُجهز والذي يحتوي على الـ 1.5 mL المتبقية من وسط نضج DC المُدفأ مسبقاً. انقل الطبق إلى الحاضنة لمدة تتراوح من 12 إلى 18 ساعة إضافية، ثم قم بحصاد وعدّ وإشعاع خلايا الـ DCs المتأثرة بالنواة. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 mL من وسط CTL، ثم أعد تعليقها بتركيز 3 × 10⁵ من خلايا الـ DCs لكل mL من الوسط. قم بتجميع حد أدنى قدره 7.5 × 10⁵ أو 2.5 mL وبحد أقصى 15 × 10⁵ أو 5 mL من خلايا الـ DCs من جميع حالات العدوى النووية الثلاث، ثم انقل خلايا الـ DC المجمعة والمنقولة بلازميد إلى جهاز G Rex.

بعد ذلك، ضع الجهاز في الحاضنة لتحضير الخلايا المستجيبة. استخدم الخلايا وحيدة النواة غير الملتصقة المتبقية بعد عملية اختيار الخلايا التغصنية (DC). انقل الخلايا المستجيبة إلى محلول استنبات التحضير المسبق.

اغسلها مرة واحدة باستخدام وسط CTL media. علّق الخلايا في وسط CTL media. قم بعدّ الخلايا واجعل تركيزها 2 × 10⁶ خلية لكل milliliter.

خذ 15 × 10⁶ خلية أو 7.5 milliliters وأضف إليها السيتوكينات IL four و IL seven. انقل 7.5 milliliters من PBMC إلى G Rex وأكمل حجم السائل في المفاعل الحيوي باستخدام CTL media ليصل الحجم الإجمالي إلى 30 milliliters. وأخيرًا، ضع G REX في الحاضنة لمدة ستة إلى سبعة أيام؛ وفي اليوم السادس أو السابع، اسحب 10 milliliters من الوسط الزرعي.

ثم اخلط الـ 20 milliliters المتبقية من الوسط باستخدام ماصة سعة 10 milliliter. استخدم صبغة trian blue لعد الخلايا إذا كان عددها أقل من 50 × 10⁶ خلية. قم بتجديد المزرعة بوسط جديد وسيتوكينات.

إذا كان عدد الخلايا أكبر من 50 × 10⁶ خلية، اسحب 10 milliliters من معلق الخلايا، وانقل الخلايا إلى G rex جديد، ثم غذِّ كلا الـ G rexes بوسط CTL طازج وسيتوكينات، واستزرع الخلايا لمدة تتراوح من أربعة إلى ستة أيام إضافية لتوسيع الخلايا إلى عدد كافٍ، ثم احصد الخلايا وقم بتعدادها. بعد ذلك، قم بحفظ أي خلايا غير مستخدمة في التحليلات المظهرية أو الوظيفية بالتجميد لاستخدامها مستقبلاً. تظهر النتائج التمثيلية أن بلازميدات DNA متعددة النسخ تحفز خلايا T نوعية للفيروسات المتعددة، كما تم قياسها بواسطة interferon gamma ly spot، وأن تردد الخلايا التفاعلية يتفوق على تردد السلالات التي تم إنتاجها باستخدام بلازميدات PHU التقليدية التي تعبر عن المستضدات نفسها.

تعد النسبة المثلى للخلايا التغصنية (DC) إلى الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) مهمة لتحفيز الخلايا التائية بقوة، كما هو موضح في هذا الشكل حيث تؤدي نسبة 1 إلى 50 إلى إعادة تنشيط دون المستوى الأمثل مقارنة بنسبة محفز إلى مستجيب تبلغ 1 إلى 20. إن استزراع الخلايا التائية السامة للخلايا (CTL) في جهاز G rex، كما يظهر في هذا الشكل، يدعم توسعاً فائقاً للخلايا التائية مقارنة بالأطباق التقليدية ذات 24 بئراً. تزيد إضافة IL-4 وIL-7 إلى المزارع من مجموعة وتخصص الخلايا الموسعة، كما هو موضح هنا حيث تم تقييم تردد الخلايا التائية التفاعلية ضد ببتيد NLV المقيد بـ HLA-A2 والمشتق من CMV PP65 في المزارع التي تم إنشاؤها في وجود أو غياب IL-4 و/أو IL-7. يوضح هذا الشكل عينة ممثلة للنمط الظاهري للخلايا التائية السامة للخلايا (CTL) متعددة الفيروسات التي توسعت بسرعة، والتي تكون متعددة النسيلات مع خليط من الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 والموجبة لـ CD8، والتي يعبر غالبيتها عن علامات الذاكرة CD45RO وCD62L. الخلايا التائية السامة للخلايا (CTLs) الموسعة تكون متخصصة لجميع المستضدات المحفزة ومتعددة الوظائف، كما تم تقييم ذلك هنا عن طريق صبغ السيتوكينات داخل الخلايا للكشف عن إنتاج interferon gamma وTNF alpha بعد التحفيز بالمستضد، كما تم تقييمه بواسطة مقايسة تحرر الكروميوم.

تتمتع الخلايا التائية السامة للخلايا (CTL) الموسعة بالقدرة على قتل الأهداف الفيروسية بشكل محدد، ولكنها لم تظهر أي نشاط غير محدد ضد الأهداف التي تعاني من عدم تطابق في مستضدات الكريات البيضاء البشرية (HLA) غير الفيروسية، وهو اعتبار حيوي للسلامة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التصنيع السريع لخطوط خلايا تائية سامة للخلايا محددة لعدة فيروسات، تكون متوافقة مع ممارسات التصنيع الجيدة (GNP) ومناسبة للنقل التكيفي إلى المرضى الذين يعانون من أمراض مرتبطة بالفيروسات. ومن شأن تبسيط هذا الإجراء أن يسهل توسيع نطاقه إلى ما بعد مرافق التصنيع المتخصصة، ويسمح بأن يصبح هذا الإجراء معياراً للرعاية الصحية للمرضى الذين يعانون من نقص المناعة والمعرضين بشدة للأمراض المرتبطة بالفيروسات.